赵阳阳　许智慧++刘妍++吴荣荣　刘新光　徐东平　韩晋

[摘要] 目的 建立一種适合临床常规检测胰岛素受体底物1（IRS1）rs1801278基因多态性的实验方法。 方法 随机收集2015年3月～2016年6月解放军第三〇二医院200名健康体检者的外周血标本，设计针对IRS1 rs1801278基因多态性位点的特异性引物和荧光探针，通过TaqMan-MGB实时荧光聚合酶链反应法检测rs1801278基因多态性，以基因测序法（金标准）进行验证，同时初步探讨IRS1 rs1801278不同基因型在本研究人群中的分布频率。 结果 TaqMan-MGB双荧光探针法鉴别IRS1 rs1801278的3种基因型，与基因测序法结果一致率为100%。IRS1 rs1801278基因多态性中T/T、C/T和C/C基因型在本研究人群中的分布频率分别为0%、1%和99%。 结论 根据单核苷酸多态性基因型特异性探针和引物所建立的TaqMan-MGB荧光探针法能快速有效地进行IRS1 rs1801278基因多态性分型，结果可靠，操作易行，然而对中国汉族2型糖尿病患者个体化治疗效果的预测价值有限，不建议临床常规开展。

[关键词] TaqMan-MGB实时荧光聚合酶链反应；胰岛素受体底物1；2型糖尿病；单核苷酸多态性；基因型

[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）10（c）-0004-05

Establishment and verification of TaqMan-MGB two-color fluorescent probe method for detecting the gene polymorphisms of insulin receptor substrate 1 rs1801278

ZHAO Yangyang1，2 XU Zhihui2 LIU Yan2 WU Rongrong3 LIU Xinguang1 XU Dongping2▲ HAN Jin3▲

1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Medical Molecular Diagnostics Institute of Biochemistry and Molecular Biology， Guangdong Medical University， Guangdong Province， Dongguan 523808， China； 2.Administration Center of Clinical Research， 302 Military Hospital of China， Beijing 100039， China； 3.Department of Pharmacy， 302 Military Hospital of China， Beijing 100039， China

[Abstract] Objective To establish an experimental method suitable for clinical routine detection of the gene polymorphisms of insulin receptor substrate 1 （IRS1） rs1801278. Methods The peripheral blood samples of 200 healthy controls in 302 Military Hospital of China from March 2015 to June 2016 were collected， the specific primers and fluorescent probe aimed at the polymorphic sites of gene polymorphisms of IRS1 rs1801278 were designed， and the gene polymorphisms of rs1801278 were detected by the TaqMan-MGB real-time fluorescence polymerase chain reaction and validated by gene sequencing method （golden standard）. The distribution frequencies of different genotypes of IRS1 rs1801278 in this population were discussed as well. Results The TaqMan-MGB two-color fluorescent probe method could identify 3 genotypes of IRS1 rs1801278， achieving 100% consistence with gene sequencing method. The distribution frequencies of T/T， C/T and C/C genotypes of gene polymorphisms of IRS1 rs1801278 in this population were 0%， 1% and 99%， respectively. Conclusion The established TaqMan-MGB fluorescent probe method based on the specific probe and primer of single nucleotide polymorphisms is rapid and effective in identifying the genotypes of gene polymorphisms of IRS1 rs1801278， the results are reliable， and the operation is easy， but the predictive value for the individualized therapeutic effect of Chinese Han type 2 diabetes patients is limited， which is not recommended for clinical routine practice.endprint

[Key words] TaqMan-MGB real-time fluorescence polymerase chain reaction； Insulin receptor substrate 1； Type 2 diabetes mellitus； Single nucleotide polymorphism； Genotype

胰岛素受体底物1（IRS1）是胰岛素受体的酪氨酸激酶底物，是介导胰岛素信号传导途径的关键蛋白，与导致2型糖尿病发病的胰岛素抵抗关系密切[1]。胰岛素抵抗指胰岛B细胞分泌受到干扰，功能减退而不能产生足量的胰岛素，表现为早期胰岛素相对不足和后期胰島素绝对不足[2]。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是不同个体基因组DNA序列同一位置上的单个核苷酸的差别，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入或缺失等。近年来研究发现，rs1801278（C>T）位点基因SNP影响胰岛素抵抗过程，参与2型糖尿病的发生发展[1-3]。本研究旨在以IRS1rs1801278（C>T）作为研究对象，建立TaqMan-MGB双荧光探针法，指导2型糖尿病临床个体化用药。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

全血DNA提取试剂盒（Qiagen公司，批号51104）；T-easy克隆试剂盒（Promega公司，批号A1360）和JM109感受态细胞（Trans公司，批号CD301-02）；质粒DNA提取纯化试剂盒（Qiagen公司，批号12181）；PCR扩增试剂（Takara公司，批号RR014A）；胶回收试剂盒（Qiagen公司，批号28704）；Probe qPCRSuperMix试剂（Trans公司，批号AQ401-01）；其他生化试剂均为国产分析纯，引物及MGB荧光探针由上海生工合成；台式高速冷冻离心机（Thermo公司）；荧光定量PCR反应仪（上海宏石）。

1.2 研究对象

选取解放军第三〇二医院检验科2015年3月～2016年6月体检健康者EDTA抗凝全血标本200例，其中男59例，女141例，平均年龄31岁，血常规和生化各项指标都在正常范围内。本研究经医院伦理委员会批准，并获得研究对象的知情同意，样本于-40℃保存。

1.3 方法

1.3.1 引物和探针设计与合成 从GenBank收录的人基因组序列中查询包含IRS1基因的染色体2基因组序列（NG_015830.1），利用Vector NTI分析软件对其进行比对分析，选择IRS1基因SNPrs1801278位点设计双色6-羧基荧光素FAM（6-carboxy-fluorescein）通道和六氯-6-甲基荧光素（Hexachloro fluorescein）HEX通道特异性荧光MGB探针引物和PCR探针，利用Primer 5.0软件设计合成对应引物，并由上海生工生物公司合成。引物/探针名称及序列见表1。

1.3.2 基因组DNA提取 严格按照Qiagen全血基因组DNA提取试剂和说明书操作（该提取试剂盒说明书显示脂血和溶血对提取DNA几乎没有影响），提取的基因组DNA测定浓度和A260/A280 OD值都在标准范围内，置于-20℃备用。

1.3.3 标准质粒构建及鉴定 PCR反应总体积50 μL。反应条件：94℃ 3 min→（94℃ 35 s→56℃ 35 s→72℃ 20 s）×35个循环→72℃ 10 min。将扩增片段回收后克隆于PGEM-T Easy载体中，转化到JM109大肠埃希菌感受态细胞中。挑取经菌落PCR鉴定为阳性的单菌落，测序，鉴定序列正确后，通过定点突变将IRS1基因rs1801278位点C/G突变为A/T获得突变质粒样本，提纯获得野生型（C/G）标准质粒和突变型（A/T）标准质粒。

1.3.4 IRS1基因rs1801278位点TaqMan-MGB双荧光探针法的建立与优化 以制备的野生型（C/G）和突变型（A/T）标准质粒为模板，对反应体系中引物、MGB荧光探针、dNTP、Mg2+的浓度以及退火温度进行筛选，选择灵敏度高、背景信号低、扩增荧光信号曲线呈典型S型的反应条件作为最适反应条件。反应条件：94℃ 30 s→[94℃ 5 s→65℃ 30 s（采光）]×40个循环。结果判定：根据典型的特异性扩增曲线判读相应型别，FAM扩增为野生型，HEX扩增为突变型。

1.3.5 IRS1基因rs1801278位点突变TaqMan-MGB双荧光探针法特异性检验 将野生型（C/G）和突变型（A/T）标准品稀释至相同拷贝数108 copies/mL[6.02×10的23次拷贝数/摩尔）×（浓度g/mL）/（MW g/mol）= copies/mL]，按不同百分比混合，用TaqMan-MGB双荧光探针法检测，获取按不同百分比混合的质粒扩增曲线。

1.3.6 健康人群样本检测及DNA测序验证 200份样本提取基因组DNA后，用确定的TaqMan-MGB双荧光探针法对其进行IRS1基因rs1801278位点分型，将198份扩增曲线显示为野生型样本全部测序，同时将应用TaqMan-MGB双荧光探针法检测结果为突变杂合型（C/T）的2例外送，要求对目标序列SNP位点进行测序检测，最终两种方法结果一致，说明采用TaqMan-MGB双荧光探针法检测IRS1基因rs1801278基因多态性结果的正确性。

2 结果

2.1 TaqMan-MGB双荧光探针法建立及特异性检验结果

野生型质粒由FAM荧光探针识别并发绿光，由通道1接收，在图1上由直线表示。突变型质粒由HEX荧光探针识别并发粉红色，由通道2接收，在图1上由虚线表示。荧光阈值一般在0.12左右，循环阈值（Ct值）为每个反应管内的荧光信号值达到荧光阈值时所经历的循环数。图1A为检测100%野生型标准质粒扩增曲线，直线在32循环（循环阈值）处超过荧光阈值，高幅度上升，虚线一直在荧光阈值下。图1B为75%野生型质粒和25%突变型质粒混合扩增曲线，直线和虚线均超过荧光阈值。图1C为50%野生型质粒和50%突变型质粒混合扩增曲线，虚线和直线同幅度上升，均明显超过荧光阈值。图1D为25%野生型标准质粒和75%突变型标准质粒混合扩增曲线，直线和虚线均超过荧光阈值。图1E检测100%突变型标准质粒扩增曲线，虚线在25循环（循环阈值）处超过荧光阈值，高幅度上升，直线一直在荧光阈值左右。当标本为纯合突变型（T/T）时，代表HEX信号的虚线上升并超过荧光阈值，代表FAM信号的直线在荧光阈值之下；当标本为突变杂合型（C/T）时，代表HEX信号的虚线和代表FAM信号的直线均上升并远远高于荧光阈值；当标本为野生型（C/C）时，代表FAM信号的直线上升并超过荧光阈值，代表HEX信号的虚线在荧光阈值之下。endprint

2.2 TaqMan-MGB双荧光探针法在健康人群IRS1 rs1801278（C>T）多态性中的检验结果

IRS1 rs1801278（C>T）SNP分型以C/C基因型（野生纯合型）为主，占99%；C/T突变杂合型仅检出2例，占1%；未见T/T突变纯合型。见表2。

2.3 基因测序法对突变杂合型和野生型IRS1 rs1801278（C>T）SNP的验证结果

测序结果为反方向测序，原C/T结果显示为G/A，如图2所示，2份用TaqMan-MGB双荧光探针法检測的突变杂合型C/T测序结果显示为G/A（图2A），相同方法检测野生纯合型C/C测序结果显示为G/G（图2B），测序结果与本方法结果显示一致。

3 讨论

全球糖尿病发病率达到3.82亿例，估计到2035年将增加到5.92亿。其中2型糖尿病最常见，占全世界糖尿病患者的90%[1]。

转染研究表明，IRS1基因的rs1801278（C>T）位点单核苷酸多态性可使细胞胰岛素刺激信号下降32%，同时通过PI3激酶途径，使磷脂酰肌醇激酶活性下降36%，IRS1表达细胞下降25%，可在正常人和2型糖尿病患者人群中导致胰岛素抵抗[2-3]。亚洲人数据显示不同人种正常人群中突变杂合型为1.1%～31.4%，突变纯合型为0%～0.69%。不同人种2型糖尿病患者中突变杂合型为1.2%～32.0%，突变纯合型为0%～0.84%[4-10]。rs1801278（C>T）位点单核苷酸多态性在国外报道有较高的变异率，对指导2型糖尿病和妊娠期糖尿病用药均有一定价值[11-12]，但国内相关研究十分有限，因此开展了此项研究。

临床上多种检测方法相继建立，其中基于凝胶电泳的检测方法包括限制性片段长度多态性法、单链构象多态性法、变性梯度凝胶电泳、等位基因特异性PCR[13-14]；基于基因组核酸检测方法包括TaqMan探针法检测、实时荧光定量PCR技术、普通DNA测序法、焦磷酸测序法、高分辨率通解度曲线法、DNA芯片检测、飞行质谱仪检测[15]。直接测序法是应用最为广泛的经典检测手段，是目前SNP检测的“金标准”，但其检测灵敏性较低，所需时间较长。基于凝胶电泳的方法分辨率较低，操作步骤繁琐，容易污染，不适合大规模的临床筛查。基于基因检测的方法灵敏性高，但需要昂贵的设备和专业的技术人员[16]。

TaqMan-MGB双荧光探针法是在TaqMan法的基础上优化而成的SNP检测方法，使用了MGB标记的TaqMan双荧光探针，在原TaqMan探针荧光淬灭基团旁连上一个MGB分子，该分子可结合于DNA小沟，大大提高了探针的Tm值，使探针与互补DNA 双链的结合更为特异。探针能识别单个碱基的变化，在很高的温度下引物结合模板效率高，既保证扩增效率，又保证了特异性，最低检出限为0.01 ng DNA，可保证在样本量少的情况下亦能取得有效结果，方法稳定，重复性好，操作简便，通量高，单批次检测所需时间为2～3 h，结果判读简单，相比于操作复杂、耗时的测序等其他SNP检测方法具有明显的优势，同时目前荧光定量PCR仪在实验室应用率较高，成本相对其他基因检测设备较低[17-19]。因此，检测IRS1 rs1801278（C>T）的TaqMan-MGB双荧光探针法适合在临床中开展。

本研究设计针对IRS1 rs1801278（C>T）的特异性双色荧光探针和PCR扩增引物，对rs1801278位点不同基因型能够快速、有效地鉴别。从200份健康体检志愿者的基因组DNA中检测出2份为C/T型，对其目标序列IRS1 rs1801278（C>T）进行测序检测，显示TaqMan-MGB双荧光探针法与测序法的一致率为100%，说明本研究建立的TaqMan-MGB双荧光探针法在检测IRS1 rs1801278（C>T）基因多态性方面的可靠性和准确性与测序法同效。

近年来，随着分子生物学技术和SNP检测技术的发展，2型糖尿病个体化治疗方面的研究取得了长足进展。在指导2型糖尿病患者胰岛素的个体化用药量方面，对这类患者进行有关IRS1基因的rs1801278位点SNP的检测对中国汉族2型糖尿病患者个体化治疗效果的预测价值有限，不建议临床常规开展。TaqMan-MGB双荧光探针法是结果可靠、操作易行的优选方法，为精准医学的发展提供参考和新的思路。

[参考文献]

[1] Li Q，Qiao Y，Wang C，et al. Associations between two single-nucleotide polymorphisms（rs1801278 and rs2943641）of insulin receptor substrate 1 gene and type 2 diabetes susce ptibility：a meta-analysis [J]. Endocrine，2015，51（1）：52-62.

[2] Onuma H，Osawa H，Makino H. Role of resistin in insulin resistance [J]. Rinsho Byori，2008，56（8）：698-704.

[3] Nandi A，Kitamura Y，Kahn CR，et al. Mouse models of insulin resistance [J]. Physiol Rev，2004，84（2）：623-647.

[4] Seeringer A，Parmar S，Fischer A，et al. Genetic variants of the insulin receptor substrate-1 are influencing the therape utic efficacy of oral antidiabetics [J]. Diabetes Obes Metab，2010，12（12）：1106-1112.endprint

[5] Florez JC，Sjogren M，Burtt N，et al. Association testing in 9，000 people fails to confirm the association of the insulin receptor substrate-1 G972R polymorphism with type 2 diabetes [J]. Diabetes，2004，53（12）：3313-3318.

[6] Alharbi KK，Khan IA，Munshi A，et al. Association of the genetic variants of insulin receptor substrate 1（IRS-1）with type 2 diabetes mellitus in a Saudi population [J]. Endocr？鄄ine，2014，47（2）：472-477.

[7] Kommoju UJ，Maruda J，Kadarkarai SS，et al. Association of IRS1，CAPN10，and PPARG gene polymorphisms with type 2 diabetes mellitus in the high-risk population of Hyd erabad，India [J]. J Diabetes，2014，6（6）：564-573.

[8] Haghani K，Bakhtiyari S. The Study on the Relationship Between IRS-1 Gly972Arg and IRS-2 Gly1057Asp Polymorphisms and Type 2 Diabetes in the Kurdish Ethnic Group in West Iran [J]. Genet Test Mol Biomarkers，2012，16（11）：1270-1276.

[9] Bodhini D，Radha V，Mohan V. Association Study ofIRS1Gene Polymorphisms with Type 2 Diabetes in South Indians [J]. Diabetes Technol Ther，2011，13（7）：767-772.

[10] Ouederni TB，Fadiel A，Stambouli N，et al. Influence of socioeconomic lifestyle factors and genetic polymorphism on type 2 diabetes occurrences among Tunisian Arab and Berber groups of Djerba Island [J]. Pharmgenomics Pers Med，2009，2：49-57.

[11] Prudente S，Di Paola R，Pezzilli S，et al. Pharmacogenetics of oral antidiabetes drugs：evidence for diverse signals at the IRS1 locus [J]. Pharmacogenomics J，2017. doi： 10. 1038/tpj.2017.32

[12] Wu L，Cui L，Tam WH，et al. Genetic variants associated with gestational diabetes mellitus：a meta-analysis and subgroup analysis [J]. Sci Rep，2016，6：30539.

[13] Kakavas VK，Plageras P，Vlachos TA，et al. PCR-SSCP：a method for the molecular analysis of genetic diseases [J]. Mol Biotechnol，2008，38（2）：155-163.

[14] Taira C，Matsuda K，Yamaguchi A，et al. Novel high-speed droplet-allele specific-polymerase chain reaction：application in the rapid genotyping of single nucleotide polymorphisms [J]. Clin Chim Acta，2013，424：39-46.

[15] Matsuda K. PCR-Based Detection Methods for Single-Nucleotide Polymorphism or Mutation：Real-Time PCR and Its Substantial Contribution Toward Technological Refi？鄄nement [J]. Adv Clin Chem，2017，80：45-72.

[16] 鐘焱，周钢.焦磷酸测序法和直接测序法检测非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变的比较研究[J].现代预防医学，2017，44（8）：1494-1498.

[17] Tomás G，Hernández M，Marandino A，et al. Development and validation of aTaqMan-MGB real-time RT-PCR assay for simultaneous detection and characterization of infectious bursal disease virus [J]. J Virol Methods，2012，185（1）：101-107.

[18] Zhang Z，Liu D，Sun W，et al. Multiplex one-step Real-time PCR by TaqMan-MGB method for rapid detection of pan and H5 subtype avian influenza viruses [J]. PLoS One，2017，12（6）：e0178634.

[19] Hao H，Liu J，Kuang X，et al. Identification of Campylo？鄄bacter jejuni and determination of point mutations assoc？鄄iated with macrolide resistance using a multiplex TaqMan MGB real-time PCR [J]. J Appl Microbiol，2015，118（6）：1418-1425.

（收稿日期：2017-07-20 本文编辑：张瑜杰）endprint