李人宇 - 黄金状 - 李咏梅 - 周家宏 -

(1. 连云港师范高等专科学校，江苏 连云港 222006；2. 淮海工学院化学工程学院，江苏 连云港 222005;3. 南京师范大学生命科学学院，江苏 南京 210023) (1. Lianyungang Teachers College, Lianyungang, Jiangsu 222006, China; 2. School of Chemical Engineering, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang, Jiangsu 222005, China; 3. College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing, Jiangsu 210023, China)

番红花红T分光光度法测定啤酒酵母中铬含量

李人宇1LIRen-yu1黄金状1HUANGJin-zhuang1李咏梅2LIYong-mei2周家宏3ZHOUJia-hong3

(1. 连云港师范高等专科学校，江苏 连云港 222006；2. 淮海工学院化学工程学院，江苏 连云港 222005;3. 南京师范大学生命科学学院，江苏 南京 210023) (1.LianyungangTeachersCollege,Lianyungang,Jiangsu222006,China; 2.SchoolofChemicalEngineering,HuaihaiInstituteofTechnology,Lianyungang,Jiangsu222005,China; 3.CollegeofLifeSciences,NanjingNormalUniversity,Nanjing,Jiangsu210023,China)

采用微波消解样品，在碱性条件下用高锰酸钾将铬(Ⅲ)转化为铬(VI)，并利用在聚乙烯醇与磷酸介质中，铬(VI)与碘化钾、番红花红T室温下会发生显色反应的原理，建立了一种测定啤酒酵母中铬含量的新方法。研究结果表明：在最佳测定条件下，该方法的检测限为14.55 μg/L，相对标准偏差为1.3%～2.1%(n=5)，样品加标回收率为97.9%～101.7%，且常见共存离子不影响测定结果。

分光光度法；铬；番红花红T；啤酒酵母

铬(Ⅲ)是人体必需微量元素，参与糖、脂类和蛋白质的代谢，具有维持耐糖量于正常水平、促进生长发育的功能。人体缺铬(Ⅲ)会引发糖尿病、冠心病、儿童发育不良等疾病，但铬(Ⅲ)过量又会危害人体健康[1-2]。啤酒酵母中富含三价有机铬，人体吸收利用率高，是天然铬(Ⅲ)的良好来源[3]，因其具有品质优、产量大、经济环保等优势，被广泛应用于食品工业中[4]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

紫外-可见分光光度计：UV-2550型，日本岛津公司；

超级恒温水浴：SYC-15C型，南京桑力电子设备厂；

酸度计：pHS-3C型，上海精密科学仪器有限公司；

微波消解仪：ETHOS E型，意大利Milestone公司；

石英亚沸高纯水蒸馏器：SYZ-B型，宜兴新建石英玻璃器厂；

重铬酸钾、磷酸、碘化钾、聚乙烯醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

番红花红T：生物染色剂，上海灵锦精细化工有限公司；

啤酒酵母粉：食品级，亳州市保华药业有限公司；

试验用水：二次蒸馏水。

1.2 试验方法

1.2.1 铬(VI)标准储备液的配制 称取0.282 9 g经105 ℃烘干2 h的基准试剂重铬酸钾，用水溶解并定容至1 L，即得100.0 μg/mL的铬(VI)标准储备液，置于冰箱4 ℃保存备用。使用时稀释成5.0 μg/mL的标准溶液。

1.2.2 样品处理 称取0.5 g(精确到0.000 1 g)啤酒酵母粉于消解罐，加入6 mL硝酸和2 mL双氧水，置于微波消解仪中，在5 min内由室温升至120 ℃并恒温5 min，再在5 min内升温至160 ℃并恒温10 min，然后在5 min内升温至180 ℃并恒温10 min，消解完毕得透明溶液。冷却后取出消解罐，在140～160 ℃电热板上赶酸至0.5～1.0 mL。冷却后将消化液转移至三角瓶中，加入40 mL水，用2 mol/L氢氧化钠调节pH至12，滴加20 g/L高锰酸钾溶液至溶液呈紫红色，在电炉上加热煮沸20 min，期间若紫红色褪去，应及时滴加高锰酸钾溶液。加热完毕后立即滴加95%乙醇使紫红色褪去，摇匀，用1 mol/L硝酸溶液调节pH至7.0，趁热过滤，滤液置于50 mL容量瓶中，并用少量热水洗涤3次，洗涤液并入容量瓶中，加水定容至刻度，即得待测样液。

1.2.3 测定方法 取2支25 mL具塞比色管，其中一支依次加入4 mol/L磷酸溶液、一定量铬(VI)标准溶液或待测样液、0.1 mol/L碘化钾溶液、10 g/L聚乙烯醇溶液、5.0×10-4mol/L 番红花红T溶液，用水定容至25 mL，摇匀；另一支为试剂空白同时配制，仅不加铬(VI)。避光反应完全后，以试剂空白为参比，用1 cm比色皿，用分光光度计在波长460 nm下测量离子缔合物体系的吸光度。

1.2.4 测定波长的选择 按1.2.3的方法分别扫描试剂空白(以水为参比)和离子缔合物体系(以试剂空白为参比)的吸收光谱，根据光谱图的最大吸收峰确定测定波长。

1.2.5 测定条件的选择 以影响反应的主要因素反应介质的选择及用量、碘化钾用量、番红花红T用量、表面活性剂的选择及用量、反应温度和反应时间为考察因素，以吸光度值为考察指标，分别进行单因素试验，按1.2.3的方法在1.2.4中的测定波长下测量吸光度，优化出适宜的测定条件。其中对于反应介质、表面活性剂的选择按以下步骤操作：分别考察盐酸、硫酸和磷酸3种介质，根据吸光度值选择反应介质，继而考察其浓度，加入1，4，10 mol/L的介质溶液各5 mL，再根据吸光度值确定介质适宜浓度，然后按以下单因素试验方法确定最佳用量。分别考察8种常用表面活性剂，其浓度为10 g/L(或10 mL/L)，用量为2 mL，根据吸光度值选择表面活性剂，再按以下单因素试验方法确定最佳用量。单因素试验步骤为：对于反应条件适宜浓度介质溶液3.0 mL、0.1 mol/L 碘化钾溶液3.0 mL、10 g/L(或10 mL/L)适宜表面活性剂溶液2.0 mL、5.0×10-4mol/L番红花红T溶液4.0 mL，反应温度20 ℃，避光反应时间15 min，逐一改变反应条件，固定其他反应条件不变进行试验，根据吸光度值确定最佳反应条件。

1.2.6 标准曲线的绘制 向6个25 mL比色管中，分别准确加入0.00，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50 mL铬(VI)标准溶液，使铬(VI)质量浓度各为0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 μg/mL，按1.2.3的方法在1.2.5的条件下测定。以吸光度为纵坐标，铬(VI)质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.7 共存离子的影响 在25 mL比色管中加入2.0 mL铬(VI)标准溶液，按1.2.3的方法在1.2.5的条件下测定吸光度；另取若干支25 mL比色管，除了加入2.0 mL铬(VI)标准溶液外，分别加入一定量待考察的共存离子，再同前述步骤测定吸光度，并计算两次吸光度测定值的相对误差，判断共存离子是否干扰铬(VI)的测定[16]。

1.2.8 样品中铬含量的测定 取2.0 mL 1.2.2待测样液于25 mL比色管中，按1.2.3的方法在1.2.5的条件下测定。根据样品的吸光度及标准曲线线性回归方程，求得样品中铬含量。测定结果与GB 5009.123—2014中的原子吸收光谱法(AAS)对照。同时做加标回收试验。

2 结果与讨论

2.1 吸收光谱

扫描440～540 nm吸收光谱见图1。试剂空白的最大吸收峰位于521 nm；铬(VI)、碘化钾和番红花红T反应生成离子缔合物的最大吸收峰位于460 nm。故选择测定波长460 nm 定量检测铬(VI)的含量。

2.2 测定条件的选择

2.2.1 反应介质 分别考察了盐酸、硫酸和磷酸介质对吸光度的影响。结果表明，磷酸介质的灵敏度最高。故选用磷酸介质，改变其浓度进一步试验，发现4 mol/L磷酸效果最佳。若使用1 mol/L磷酸，基本不反应，吸光度几乎为0；若使用10 mol/L磷酸，反应过快体系不稳定，吸光度数值变化大，造成测定不准确。当4 mol/L磷酸溶液用量为3.0 mL，吸光度最大(见图2)。因此，后续试验加入4 mol/L的磷酸溶液3.0 mL。

1. 试剂空白 2. 离子缔合物图1 吸收光谱Figure 1 Absorption spectra

图2 磷酸用量对吸光度的影响Figure 2 Effect of phosphoric acid volume on absorbance

2.2.2 碘化钾溶液(0.1 mol/L)用量 由图3可知，当碘化钾溶液加入量为3.0 mL时，吸光度最大。因此碘化钾溶液用量选用3.0 mL。

图3 碘化钾用量对吸光度的影响Figure 3 Effect of potassium iodide volume on absorbance

2.2.3 番红花红T溶液(5×10-4mol/L)用量 由图4可知，当加入4.0 mL番红花红T溶液时，吸光度最大。因此番红花红T溶液用量选用4.0 mL。

图4 番红花红T用量对吸光度的影响Figure 4 Effect of safranine T volume on absorbance

2.2.4 表面活性剂 由表1可知，与未加表面活性剂相比，加入聚乙烯醇，吸光度显著增大，增敏效果明显优于其他表面活性剂，此外其增稳效果也好，吸光度数据更稳定，有利于准确测定。加入β-环糊精或阿拉伯树胶，吸光度增幅较小，灵敏度略有提高。加入其他表面活性剂，吸光度均减小，灵敏度不同程度降低。故选用10 g/L聚乙烯醇作增敏增稳剂。由图5可知，聚乙烯醇适宜用量为2.0 mL。

表1 表面活性剂对吸光度的影响Table 1 Effect of surfactant on absorbance

图5 聚乙烯醇用量对吸光度的影响Figure 5 Effect of polyvinyl alcohol volume on absorbance

2.2.5 反应温度 由图6可知，温度为5 ℃时反应较容易发生，吸光度较大；温度为10 ℃时能反应完全，吸光度达到最大，温度升至40 ℃，吸光度基本不变；温度升至50～100 ℃时，吸光度明显减小，这是由离子缔合物的稳定性降低造成的。考虑测定的灵敏度和操作的简便性，选择室温下反应。

图6 反应温度对吸光度的影响Figure 6 Effect of reaction temperature on absorbance

2.2.6 反应时间与稳定性 由图7可知，反应初期，吸光度逐渐增大；反应15 min时，吸光度达到最大，在聚乙烯醇增稳作用下能保持175 min基本不变(相对误差<-5%)。说明铬(VI)、碘化钾和番红花红T的显色反应在15 min内即可完成，生成的离子缔合物能稳定维持175 min。故选择反应时间为15 min。本法的反应时间和稳定性均优于传统的二苯碳酰二肼分光光度法[7, 9-10]，反应时间缩短一半，稳定时间延长1.9倍。

图7 反应时间对吸光度的影响Figure 7 Effect of reaction time on absorbance

2.3 标准曲线

由图8可知，铬(VI)质量浓度在0.0～0.5 μg/mL时，符合朗伯—比尔定律，线性回归方程为A=1.326ρ-0.008 4，r=0.999 5，表观摩尔吸光系数ε460=6.90×104L/(mol·cm)。平行测定11次试剂空白A0，得标准偏差为6.43×10-3，该计算方法的检出限(3s/k)为14.55 μg/L。

2.4 干扰试验

图8 标准曲线Figure 8 Standard curve

2.5 样品分析

由表2可知，番红花红T分光光度法测定结果与原子吸收光谱法[5]一致，且相对标准偏差为1.3%～2.1%，表明该方法准确可靠，重现性好。

由表3可知，平均回收率为97.9%～101.7%，表明该方法测定结果准确。

表2 啤酒酵母中铬含量测定结果Table 2 Results for the determination of chromium in beer yeast (n=5)

表3 回收试验结果Table 3 Results of test for recovery (n=5)

3 结论

本试验建立了一种适用于啤酒酵母中铬含量测定的番红花红T分光光度法，该方法快速，有较高的准确度、灵敏度和精密度，符合常规检测要求。与传统的二苯碳酰二肼分光光度法相比，该方法避免使用有毒溶剂，反应时间缩短、提高样品分析速度，稳定可持续测定时间明显延长、能保证测定准确度。

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SpectrophotometricdeterminationofchromiumcontentinbeeryeastwithsafranineT

A new spectrophotometric method for determination of chromium content was developed. In both polyvinyl alcohol and phosphoric acid medium, chromium (VI) could react with potassium iodide and safranine T at room temperature, leading to coloration after microwave digestion sample and oxidation of chromium (III) to chromium (VI) with potassium permanganate under alkaline conditions. The effects of the factors such as absorption spectra, reaction conditions and coexisting ions on the reaction were discussed. The results showed that under the optimum determination conditions, Beer-Lambert law was obeyed in the mass concentration range of 0.0～0.5 μg/mL for chromium with the maximum absorption peak at 460 nm. The detection limit was 14.55 μg/L. The apparent molar absorption coefficient was 6.90×104L/(mol·cm). This method had been applied to the determination of chromium content in beer yeast. The results obtained by this method agreed well with those obtained by atomic absorption spectrometry. RSD was in the range of 1.3%～2.1% (n=5), and recovery was in the range of 97.9%～101.7%. Moreover, a large number of common coexisting ions did not affect the determination.

spectrophotometry; chromium; safranine T; beer yeast

2015年度国家自然科学基金面上项目(编号：21571105)；2014年江苏省高校“青蓝工程”资助项目；2015年度连云港市第五期“521工程”科研项目(编号：201529)；2015年江苏省高等学校大学生创新创业训练计划项目(编号：201511585003Y)

李人宇(1972—)，男，连云港师范高等专科学校教授，博士。E-mail: lirenyu518@163.com

2017—05—27

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.09.015