闫 敏，李 磊，张 强，冯悦晨，孙 捷，武文丽

(山西省农业科学院农业环境与资源研究所，山西 太原 030031)

菌株F75风化煤降解特性研究

闫 敏，李 磊*，张 强，冯悦晨，孙 捷，武文丽

(山西省农业科学院农业环境与资源研究所，山西 太原 030031)

【目的】 利用微生物能有效提高风化煤类物质的转化效率。由于地理环境和形成年代及条件的差异，使得风化煤理化性质差异较大，直接影响了微生物的降解作用，所以明确微生物菌株对不同风化煤的降解特性能有效提高其转化效率。【方法】本研究以3个不同来源的风化煤样为研究材料，筛选了具有降解作用的微生物菌株F75并进行鉴定。【结果】在固体和液体培养条件下，从风化煤样的各腐植酸含量及结构的变化上分析菌株对其的降解特性。菌株F75对3个风化煤样均有降解作用，经鉴定为黑曲霉。液体培养条件下，风化煤YF01和YF09在190～280 nm的吸收曲线较对照呈现先增加后减少的趋势，而风化煤YF06则呈现较对照一直增加的趋势，且3个风化煤样均在小于205 nm时有明显的加强。红外光谱分析显示菌株F75对风化煤YF01的作用集中在碳链的缩短上，表现为失重率较高；对风化煤YF06和YF09的作用集中在羧基官能团上，表现为水溶性腐植酸和黄腐酸含量的增加。固体培养条件下，菌株F75对风化煤YF06的游离腐植酸含量提高明显；菌株F75对3个风化煤样的水溶性腐植酸含量和黄腐酸含量均有明显提高，其中对风化煤YF09中水溶性腐植酸含量的增加呈主导作用，而对风化煤YF06中黄腐酸的含量有一定的消耗作用。【结论】菌株降解风化煤的作用在失重率和腐植酸类物质含量上因不同的风化煤样而存在不同的主导作用，可以指导风化煤进一步的转化生产。

风化煤；微生物降解；腐植酸；红外光谱

【研究意义】风化煤是一种经济价值较低、裸露于地表或位于地表浅层已经风化的煤。因其含有大量再生腐植酸和多种含氧活性功能团[1]，具有较大的利用价值，也是腐植酸的主要来源之一。腐植酸广泛用于石油开采、陶瓷工业、医药卫生和环境保护等领域[2-3]，特别是在农业上也具有广阔的应用前景[4-8]。【前人研究进展】我国风化煤贮藏量十分巨大，大量分布于山西、新疆、内蒙古、黑龙江、云南等地区。但是，由于地理环境和形成年代等差异，使得各风化煤的理化性质存在巨大差异，直接影响了其利用的效果。韩威[9]等对8种微生物对23种煤样的研究表明菌种对煤样的生物溶媒效果差异较大；张昕[10]等研究了4种真菌降解山西临汾和内蒙古风化煤后的失重率的平均差异在10 %左右；冯晓霄[11]等研究的微生物菌株对新疆低阶煤的转化率为50 %左右；王春颖[12]等通过优化工艺参数使风化煤的降解率达到29.28 %。类似的研究表明，同一微生物菌株因不同风化煤样而存在明显的转化差异，不同微生物菌株对同一风化煤样也存在明显的转化差异，即微生物菌株对不同的风化煤样存在不同的降解特性，同时发酵工艺的优化可以提高降解率，这就使得微生物菌种与风化煤之间匹配及降解特性的研究显得十分重要。【本研究切入点】本研究以3个不同来源的风化煤样为研究材料，其总腐植酸、游离腐植酸和黄腐酸的含量存在明显差异；筛选出具有降解作用的微生物菌株F75，并在固体和液体培养条件下，从各腐植酸含量及结构的变化上分析菌株对其的降解特性。【拟解决的关键问题】为优化其发酵工艺、提高风化煤的降解效率及进一步应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株：菌株F75，以风化煤为唯一碳源，分离自菜园土壤，保存于本实验室。供试风化煤：3种不同来源的风化煤，理化性质见下表[检测由中国腐植酸工业协会腐植酸质量检测中心(太原)完成]。

从表1可以看出，3个风化煤样在总腐植酸、游离腐植酸和黄腐酸的含量上存在明显差异。其中，风化煤YF01的总腐植酸和游离腐植酸含量基本一致，且较高，风化煤YF06的总腐植酸含量较高而游离腐植酸含量较低，风化煤YF09的总腐植酸含量和游离腐植酸含量且较低。供试培养基[10]：①固体定性培养基：Na2HPO44.0 g，KH2PO41.0 g，NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.05 g，酵母浸出粉6.0 g，去离子水1000 mL，琼脂15～20 g。②液体培养基：(NH4)2SO42.6 g，K2HPO41.0 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.01 g，去离子水1000 mL，风化煤10.0 g，pH值为6.0。③无机盐溶液：(NH4)2SO43.7 g，K2HPO41.0 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.01 g，去离子水1000 mL。④葡萄糖无机盐营养液：每升无机盐营养液加入5 g葡萄糖。

1.2 菌株F75对风化煤样降解能力的筛选

将纯化的菌种接种到固体定性培养基上，28 ℃下培养5～7 d。待菌丝长满平板表面，将灭菌后风化煤均匀洒在菌丝上，继续培养，每日观察并记录风化煤颗粒被溶解的情况。

1.3 风化煤降解菌株的鉴定

形态学鉴定：对分离到的菌株采用PDA平板、显微镜(乳酸石炭酸棉兰染色),对菌落、菌丝、孢子等结构进行观察，并参照《真菌鉴定手册》[16]和《中国真菌志》[17]进行鉴定。

分子生物学鉴定：采用生工公司生产的Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取该菌的DNA，并进行PCR扩增18S rDNA序列，引物采用真菌18S rDNA序列扩增通用引物NS1(5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’)和NS6(5’-GCATCACAGACCAGATATTGCCTC-3’)。PCR反应体系为：10×Buffer(with Mg2+) 2.5 μl，dNTP(各2.5 mM)1.0 μl，引物(10 μM)各 0.5 μl，Taq酶(2 U/μl)0.2 μl，DNA模板0.5 μl，加无菌水补至25 μl。PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环，72 ℃延伸10 min。PCR产物委托上海生工有限公司进行测序。 将18 S rDNA测序结果提交到NCBI数据库并进行BLAST比对。

在我国众多工程测绘工作中，不动产测绘是重点内容，它不仅可以为房产测绘工作提供数据指导，同时也可以为城市现代化建设提供帮助。然而不动产测绘在实际的应用过程中还存在一些缺陷和不足，这就导致不动产统一登记管理工作无法发挥出实质性作用，同时也阻碍了城市化建设的进一步实施。因此，相关研究工作人员必须要给予高度重视，切实提高不动产测绘的水平和质量，确保不动产统一登记管理工作有条不紊地进行，最终加快我国城市化建设的步伐。

表1 3个风化煤样的理化性质

图1 菌株F75对3个风化煤样的降解Fig.1 Degradation of 3 kinds of weathered coal by strain F75

1.4 风化煤液体降解特性的研究

将菌株活化后，接种到液体培养基中，50 mL培养基接种量为1/4个平板。28 ℃下培养7 d后，离心(12 000 r/min)15 min，上清液稀释12.5倍后测定190～280 nm(间距5 nm)的吸光度；测定上清液中黄腐酸、水溶性腐植酸的含量[18]。同时将上清液先用6 mol·L-1H2SO4调节pH值至1,形成絮状沉淀,然后离心(12 000 r/min)15 min,沉降物在75 ℃烘干,即得固体水溶性组分并进行FT-IR分析[9-10]。沉降物在75 ℃烘至恒重，计算损失的质量，失重率为培养基中加人的风化煤质量与沉降物质量(包括菌体和未分解的风化煤)之间的差值与原加入风化煤的质量之比，用百分数表示。同时做不接种的空白对照(CK)，重复3次。

1.5 风化煤固体降解特性的研究

准确称取10.0 g风化煤于150 mL三角瓶中，每瓶接种1/2平板的活化菌株并进行如下处理：①加入3 mL无机盐营养液，②加入3 mL葡萄糖无机盐溶液，并分别进行灭菌和不灭菌处理；每瓶中补水至28 ℃培养30 d，7～10 d补1次水(约3 mL)，以维持合适的湿度(含水量约为30 %)，每个处理做3次重复。同时做灭菌和不灭菌的不接种处理为对照。培养结束时将培养物在75 ℃下烘干并研细，测定黄腐酸、水溶性和游离性腐植酸的含量[16]。

图2 菌株在PDA上的菌落形态Fig.2 Colony morphology of strain on PDA

1.6 数据分析

试验数据采用Mintab 14 软件进行统计分析, 采用Tukey’s 进行多重比较。文中图采用Excel 绘制,图中数据表示为3 次重复的平均值±标准误(SE)。

2 结果与分析

2.1 菌株F75对风化煤降解作用的筛选

将菌株在固体定性培养基上培养，待菌丝基本长满平板后加入风化煤继续培养，3 d后，培养基被染成了棕黄色(图1)，说明菌株F75对3个风化煤样(YF01、YF06、YF09)均出现了不同程度的溶煤现象。

2.2 菌种鉴定

菌株F75在PDA平板上菌落生长快，表面黑色粉末状(图2)；分生孢子头的顶囊球形或近球形(图3)，小梗双层，第一层粗大，第二层短小，呈放射状排列，布满整个顶囊，顶端有链形孢子，初步判定F75为黑曲霉。

将测得的18SrDNA基因序列在 NCBI 上进行同源性检索(图4)，结果表明，所测序列与黑曲霉(Aspergillusniger) 同源性为 100 %。综合形态特征和18SrDNA基因序列同源性两方面分析，该菌株鉴定为黑曲霉(Aspergillusniger)。

图3 菌株在显微镜下的生长形态Fig.3 Growth morphology of strain under microscope

图4 菌株的18SrDNA 序列PCR扩增产物Fig.4 Result of Genomic DNA ITS PCR amplification

图5 培养物上清液的吸收曲线Fig.5 Ultraviolet absorption curve of culture supernatant

2.3 风化煤液体降解特性的研究

2.3.1 液体培养下降解物紫外分析 从图5可以看出，经菌株F75液体培养条件下的降解后，风化煤YF01和YF09在190～280 nm的吸收曲线是相似的。接种处理与不接种处理相比，提高小于205 nm的吸光值，降低大于205 nm的吸光值，说明该菌株分解了风化煤中水溶性组分，特别是吸收大于205 nm紫外光的物质。而风化煤YF06的吸收曲线与YF01和YF09不同，接种处理和不接种处理的紫外吸收曲线相似，但接种处理的吸光度明显高于不接种处理，并且波长越短，增加的幅度越高。这说明培养过程中风化煤中有大量的物质，可能是腐植酸类物质转化为水溶性状态，所溶解出来的物质组成也受到接种微生物菌株的影响，吸收低波长紫外光处的物质显著增加，随着波长的增大吸光值得增量有所下降。

图6 风化煤YF01培养物的红外吸收光谱Fig.6 IR spectra of weathered coal YF01 cultures

图7 风化煤YF06培养物的红外吸收光谱Fig.7 IR spectra of weathered coal YF06 cultures

2.3.2 液体培养下降解物红外分析 从图6可以看出，接种菌种F75与对照相较，谱图的形状基本相似，在1400 cm-1(脂族C-H变形振动)处减弱，1230～1034 cm-1处峰形平缓且有肩峰，而在910、600～760 cm-1处发生了不同程度的位移，说明可能是碳链缩短、羧基官能团含量存在差异，结构较复杂且另含有其他官能团，降解作用较强。

从图7可以看出，接种菌种F75与对照相较，谱图的形状基本相似，在1720 cm-1处有一个缺失的小峰，1652～1631 cm-1处多出3个肩峰，而在760 cm-1处的峰形较平缓；说明菌株F75降解风化煤YF06后产生的羧基官能团类物质种类多，结构复杂。

从图8可以看出，接种菌种F75与对照相较，谱图的形状基本相似，1266～1035 cm-1处多出5个肩峰，937～858 cm-1处有3个加强峰及小位移，760 cm-1处有2个加强峰；说明在羧基官能团上含量较多且结构较复杂，而在C-H弯曲的面外振动有明显的加强，即菌株F75对风化煤YF09的降解可能更多的集中在腐植酸类物质上，其含量可能增加量较大。

2.3.3 液体培养下风化煤的降解特性 从风化煤液体培养后的失重率(图9)变化看出，接种菌株F75后各风化煤的失重率明显高于对照。对照处理的风化煤YF01、YF06、YF09的失重率分别是5.0 %、4.5 %和11.5 %；接种菌株F75后的失重率为19 %、13 %、24 %。其中接种菌株F75后，对风化煤YF01的降解效果最好。

图8 风化煤YF09培养物的红外吸收光谱Fig.8 IR spectra of weathered coal YF09 cultures

图9 液体培养下风化煤的失重率Fig.9 Weight loss rate of weathered coal under the condition of liquid culture

从风化煤液体培养后的上清液中水溶性腐植酸含量的变化(图10)看出，接种菌株F75后各风化煤培养液中水溶性腐植酸的含量相较于对照均明显提高。对照风化煤YF01、YF06、YF09的培养液中水溶性腐植酸的含量分别是1.25 %、0.27 %和1.56 %；接种菌株75后的培养液中水溶性腐植酸的含量约为2.33 %、1.70 %、2.94 %。其中接种菌株F75后，风化煤YF06的降解效果最好，由于对照风化煤YF06的水溶性腐植酸含量最低，故而其增效最大。

从风化煤液体培养后的上清液中黄腐酸含量(图11)的变化看出，接种菌株F75后各风化煤培养液中黄腐酸的含量相较于对照均明显提高。对照风化煤YF01、YF06、YF09的培养液中水溶性腐植酸的含量分别是0.56 %、0.32 %和0.62 %；接种菌株F75后的培养液中水溶性腐植酸的含量约为1.44 %、1.31 %、1.68 %。其中接种菌株F75后，风化煤YF06的降解效果最好，而风化煤YF09的黄腐酸的含量最高。

2.4 风化煤固体降解特性的研究

3个风化煤样经过固体培养后，腐植酸的含量发生了明显的变化。从表2可以看出，①接种菌种后风化煤中游离腐植酸的含量有所增加。风化煤YF01和YF09的游离腐植酸含量在各处理中较对照的变化不明显；而风化煤YF06游离腐植酸含量较对照则明显提高，而且加糖高于不加糖，不灭菌高于灭菌，说明加糖可促进菌种生长，且对于风化煤YF06的降解存在菌种之间的协同作用。②在固体培养后风化煤的水溶性腐植酸含量的变化上，接种菌种较于不接种有大幅度的提高。风化煤YF01和YF06的处理中，灭菌处理的加糖高于不加糖，不灭菌处理不加糖高于加糖，说明菌株F75对风化煤的降解机理与风化煤自身微生物的降解机理不同。而在风化煤YF09的各处理中，不加糖高于加糖，且灭菌高于不灭菌，说明对风化煤YF09的降解以菌株F75为主。③从风化煤固体培养后黄腐酸的变化看，风化煤YF01和YF09的表现相似，不加糖高于加糖，可能菌株F75的生长对黄腐酸有所消耗，但不大；风化煤YF06的处理中，加糖促进了风化煤的降解，但接种较不接种提高幅度不大，菌株F75的生长的黄腐酸有明显的消耗。综上所述，在固体发酵中，对于风化煤YF01和YF09应不加糖或少加糖来提高水溶性腐植酸和黄腐酸的含量，而风化煤YF06可以通过添加糖来提高游离腐植酸和水溶性腐植酸的含量。

图10 液体培养下风化煤的水溶性腐植酸含量Fig.10 Water soluble humic acid content of weathered coal under the condition of liquid culture

图11 液体培养下风化煤的黄腐酸含量Fig.11 Fulvic acid content of weathered coal under the condition of liquid culture

2.5 风化煤的理化性质

山西风化煤储量巨大，约为80亿吨，且煤种丰富。目前，笔者组已收集到10份来自不同产地的风化煤，其中山西风化煤6种。其理化性质见表3。

从表3可以看出，仅仅是由于地理环境的不同，就使得风化煤的理化性质差异较大。根据总腐植酸、游离腐植酸和黄腐酸的含量，以及pH值的差异，我们选取了YF01、YF06和YF09号风化煤作为研究材料。其中风化煤YF01的总腐植酸和游离腐植酸含量都较高，风化煤YF06的总腐植酸含量较高而游离腐植酸含量较低，风化煤YF09的总腐植酸含量和游离腐植酸含量基本接近且较风化煤YF01低许多。以期从3个差异较大风化煤样入手，解析它们对菌株降解的响应，为进一步的机理研究和生产提供依据。

表2 固体培养后各风化煤的性质

表3 风化煤的理化性质

3 讨论与结论

近年来，国内外针对利用微生物转化煤类物质开展广泛的研究，降解微生物主要包括白腐菌、曲霉、木霉、青霉、链霉菌、假单胞菌及芽孢杆菌的一些属等。本研究中降解微生物是黑曲霉，对3个风化煤样均具有不同程度的溶解作用。黑曲霉广泛分布于粮食、植物产品和土壤中；运用历史悠久，被美国FDA认证为安全菌种(GRAS)。由于其产纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶等被用于饲料生产，秸秆腐熟等，也可用于风化煤的降解研究。HA的红外光谱[21-23]中的吸收峰主要出现在以下区域：2920 cm-1(不对称脂族C-H伸缩振动)，2850 cm-1(-CH2-对称脂族C-H伸缩振动)，1720 cm-1(羧基的 C=O伸缩振动)，1620 cm-1(芳香C=C伸缩振动)，1400 cm-1(脂族C-H变形振动)，1230 cm-1(羧基中-OH的变形振动和C-O伸缩振动)和1034 cm-1(碳水化合物或多糖结构中C-O伸缩振动及无机物的Si-O伸缩振动)。张昕等[10]的研究中，1280～1580 cm-1有尖锐的吸收峰，2500～2000 cm-1的吸收峰向高波数移动，660 cm-1吸收的消失，暗示氢键结合减少；内蒙古乌海风化煤经WF2作用后，减弱。本研究发现，菌株F75对风化煤YF01的作用集中在碳链的缩短上，表现为失重率较高；对风化煤YF06和YF09的作用集中在羧基官能团上，表现为水溶性腐植酸和黄腐酸含量的增加，而且在羧基振动上变化较多，结构复杂，可能存在多种腐植酸类物质，有利于降解产物的利用，若进行定向消耗可加速风化煤的降解程度。同时，菌株F75对风化煤YF01 的液体降解后失重率最高，而风化煤YF 06和YF09则是水溶性腐植酸含量和游离腐植酸的含量明显增加，这一结果和红外光谱分析的结果一致。总之，可以从菌株F75对3个风化煤样的降解特性的差异进一步对其降解机理和降解效果进行研究。

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StudyonCharacteristicsofStrainF75DegradingWeatheredCoal

YAN Min,LI Lei*,ZHANG Qiang, FENG Yue-cheng, SUN Jie, WU Wen-li

(Institute of Agricultural Environment and Resources, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Shanxi Taiyuan 030031, China)

【Objective】Microbes can effectively improve the conversion efficiency of weathered coal. Due to the differences of geographical condition and age, weathered coals usually showed different physical and chemical properties，which affected the degradation of microbes. Therefore, the definition of degradation characteristics of different weathered coals could effectively improve its conversion efficiency. 【Method】In this study,taken Three different sources of weathered coal as tested materials, the strain ‘F75’ was screened and identified, which could degrade weathered coal. 【Result】Under the solid and liquid culture, the degradation characteristics of the contents and structure of humic acids of the strains from weathered coals were analyzed.The strain ‘F75’ could degrade the three sources of weathered coals and was identified as Aspergillus niger. Under the liquid culture, the UV analysis showed that the curves of F75 to the YF01 and YF09 increased firstly and then decreased from 190 nm to 280 nm, whereas the curve of F75 to the YF06 increased in this stage, and all the weathered coals showed obvious enhancement before 205 nm. The results of FT-IR showed that under the action of YF01, the carbon chain of F75 was shortened, with higher rate of weight loss, and for the YF06 and YF09, the content of water-soluble humic acid and fulvic acid increased, which implied that the effect of F75 to YF06 and YF09 concentrated in the carboxyl groups. Under the solid culture condition, the content of free humic acid of YF06 significantly increased when F75 was added; The content of water soluble humic acid and fulvic acid of three weathered coals significantly increased with F75 addition, of which the increase of water soluble humic acid had a dominant effect on YF09 and some consumption effect on YF06. 【Conclusion】During the degradation of different sources of weathered coals according to the rate of weight loss and the content of humic substances, the strain had different dominant effects, which would guide the further transformation of weathered coal.

Weathered coal; Microbial degradation; Humic acid; FT-IR

1001-4829(2017)10-2360-07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.033

2016-11-20

土壤环境与养分资源山西省重点实验室基金(2013004)；山西省农科院重点项目(YZD1511)

闫 敏(1975-),女，河北深县人，硕士，副研究员，主要研究方向是农业微生物资源利用，ymrice@163.com，*为通讯作者， E-mail: tfslilei@163.com。

S154.39

A

(责任编辑 陈 虹)