卢秀娴 张思远 叶贺佳 梅廷媛/广州市华南农大生物药品有限公司

鸡传染性支气管炎病毒广东分离株S1基因的克隆与序列分析

卢秀娴 张思远 叶贺佳 梅廷媛/广州市华南农大生物药品有限公司

鸡传染性支气管炎 （infectious bronchitis，IB）是由鸡传染性支气管炎病毒 （infectious bronchitis virus）引起的一种急性、高度接触性传染病，主要影响呼吸系统、消化系统、泌尿生殖系统等。各种日龄的鸡都会感染IBV，主要引起呼吸困难、肾炎、产蛋量和蛋品质的下降，IBV 还可侵害肾脏、肠道、腺胃、肌肉等组织，给养禽业带来经济上的损失。IBV自身有结构特殊性，并且RNA聚合酶具有不完善的纠错机制能力，使得病毒基因组在复制的过程易突变和重组频率增高，能够产生许多血清型，目前已报道的血清型已有30多种，在我国主要以Mass，T，Gray 和 Holte 株等为主。

IBV基因组为线性单股正链RNA，全长约27.6 kb，编码小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、核衣壳蛋白（N）和纤突蛋白（S）4 种主要结构蛋白。当S蛋白与宿主细胞膜上的病毒受体结合，并通过宿主细胞的蛋白酶裂解到S1和S2时，病毒包膜可与细胞膜结合，病毒纤突能表现出较强的特异性，S1基因是诱导和选择性接受中和抗体的特异位点。S1可刺激中和和血凝抑制抗体，只有S1蛋白能诱导中和抗体，使机体起到有效地保护。虽然IBV的遗传变异可以在基因组中的任何部分发生，但主要集中在病毒的S1基因。

S1蛋白是主要的感染性和致病性的病毒蛋白，其结构差异性导致了血清型的差异及变异株的存在，并且与IBV抗原性漂变和致病性的改变有关，并且还可以决定IBV血清型特异性抗原决定簇。S1蛋白的氨基酸序列之间的差异性有可能改变毒株之间的血清型，导致新的变异株出现，使其抗原性或免疫原性的改变。

本研究于2017年5月份在广东省某疑似患鸡传染性支气管炎的鸡场病料被分离到1株IBV，并对IBV分离株 S1基因进行克隆、测序和序列基因遗传变异分析。

一、材料与方法

1.病料来源、SPF鸡胚及主要的试剂

病料样品为2017年5月广东某鸡场疑似感染IBV鸡的气管、心脏、肝脏、肾脏等样品；10日龄SPF鸡胚购自梅里亚实验动物中心；11日龄SPF鸡胚购自梅里亚实验动物中心； RNA提取试剂盒购自TaKaRa公司、DL2000 DNA Marker均购自北京全式金公司；2XPhanta PCR Master Mix购自诺唯赞生物公司；反转录试剂盒和核酸染料均购自TIANGEN公司，pMD20-T载体购自TaKaRa公司

2.引物设计与合成

根据Genbank中公布的IBV S1基因组序列，利用 Primer premier 6.0软件及oligo6.0，针对IBV基因组S1基因的保守基因区间设计1对特异性检测引物 IBS1(上 游 )：5'-TTCAGGTGGCGTTGATAC-3'(下 游 )：5'-AACCTTGGCCTACTCTGC-3'；根据 S1基因两端外的保守序列设计1对扩增S1全长基因的引物，引物的理论跨幅为1722bp，可将S1 基因片段完全覆盖，引物序列：S1P1(上游)：5'-TTGAAAACTGAACAAAAGA-3'，S1P2(下游 )：5'-CCATAACTAACATAAGGGCA-3'。由英潍捷基贸易有限公司合成引物。

3.病毒分离

采集临床病料（主要是气管肝脏、肾脏等组织），研碎后加入适量PBS，在-20℃和常温条件下反复冻融3次，8000 r/min离心10 min，取上清液，加入双抗（含200 U/ml 青霉素和200μg/ml链霉素）混合，作用2 h后，取0.2 ml接种于11日龄SPF鸡胚的尿囊腔，放于37℃培养箱中孵育。36～48 h后收取鸡胚的尿囊液，连续在SPF鸡胚上盲传3代。

4.IBV分离株RT-PCR鉴定和S1全长基因扩增

提取病毒的尿囊液中的RNA基因组，按照天根反转录试剂盒说明书进行反转录。以合成的cDNA为模板，采用S1基因特异性检测引物与S1基因全长引物分别进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 S，54℃退火30S，72℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸10 min。PCR反应结束后取产物以110V，50 mA电流进行电泳，结果约25 min后在凝胶成像系统紫外灯下观察。

5.IBV分离株S1基因的克隆测序

按照胶回收试剂盒说明书，回收PCR扩增的IBV S1全长基因片段，将回收的PCR产物与pMD20-T克隆载体4℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂平板蓝白斑筛选，挑去白色单菌落接种到 LB液体培养基中，于37℃恒温培养振荡器内震荡培养12 h后，菌液经PCR鉴定后，呈阳性的被选送至英潍捷基贸易有限公司测序部进行基因全长序列的测定及拼接。

6.IBV分离株S1基因的序列分析

MEGA6.0分析软件进行比较测定的S1基因序列，与参考株绘制遗传进化树。其中序列比对使用Clustal W多重比对方法，在进化树绘制中选用Neighbor-Joining算法。

二、结果与分析

1.病毒的分离与鉴定

将病料进行处理与分离培养，利用针对IBV的S1基因特异性检测引物和S1全长基因的引物，通过RTPCR对鸡胚尿囊液进行扩增，结果能扩增出大小约为500 bp、1 722 bp的两条预期目的片段，而阴性对照没有扩增出条带（图1和图2），表明该毒株为IBV，命名为CKGD/180/2017 。

2.S1基因序列分析

CK/GD/180/2017 S1基因全长1 620 bp(从起始密码子ATG到S前体蛋白裂解位点)，编码540个氨基酸，其裂解位点为RRFRR，与疫苗株 W93、D41的裂解识别位点相同。和50株国内外代表及常用疫苗株的S1基因序列进行了比较，同源相似性为64.7%～99.4%；与同一基因型的参考毒株CK/CH/HN/HN99等间相似性较高，为99.5%，与目前我国常用疫苗 Mass型的疫苗毒株相似性偏低，与 H120和H52之间的相似性仅80%～82.2%。

图1 分离株S1基因te’xRT-PCR鉴定电泳图

图2 分离株S1全长基因RT-PCR扩增电泳图

序列分析表明，与其他参考毒株相比，分离株CK/GD/180/2017的S1基因核苷酸序列存在大量的点突变， 还伴有碱基的插入、缺失现象，仅在少数区域相对保守，主要集中在19～25、116～120位氨基酸处变异。IBV中和抗体产生相关的抗原位点分别位于S1蛋白的第24～61、第132～149，第291～398处氨基酸。相关区域的抗原存在氨基酸突变、插入、缺失现象，这可能导致病毒抗原性和血清型的改变，并导致免疫失败。

3 S1基因系统发育进化关系分析

图3 IBV S1基因系统进化树

将测定的分离株CK/GD/180/2017的核苷酸序列与参考毒株构建进化树(结果见图3)，结果发现包括标准毒株在内，所有毒株共分为9个基因型（LX4株、QXIBV株等组成I群；英国分离株4/91与UK/7/93组成基因II群；河南分离株 CK/HN/HN99 等组成基因III群；广东分离株CK/CH/GD/ZJ10/2013、HN08株组成基因Ⅳ群、台湾分离株 TW2575/98 和TW2296/95等组成V群；CK/CH/GX/NN11-4株等组成基因Ⅵ群； JASS株等组成的基因Ⅶ群，肾型分离株 ARK99 株、Holte 株等组成Gray型，疫苗株H120等代表的 Mass型），其中CKGD/180/2017属于基因Ⅲ群，与H120代表的 Mass型疫苗株的亲缘关系较远。

三、讨论

在本研究中，同一分支的参考毒株与CK/GD/180/2017属于基因型Ⅲ群，其核苷酸序列和推导的氨基酸序列具有高度同源性，分别在91.9%～99.4%和93.9%～99..4%之间，裂解位点RRFRR，是否发生重组，是否因为基因的突变缺失插入现象，导致其毒力和致病性增强和组织嗜性发生改变，仍需进一步验证。病毒中和抗体和血凝抑制抗体都是S1基因诱导产生，并介导病毒与宿主细胞结合，所以常用S1基因的遗传进化关系、序列分析来研究IBV的流行趋势。

目前广东省内普遍使用的主要是Mass型H120和H52疫苗，但由于IBV基因组传播过程中会导致多种基因型及血清型毒株的产生，如果地方流行毒株和疫苗毒株的血清型不一致，仅用单一或两个血清型的疫苗，就不能有效的保护，不同血清型之间仅有部分或完全没有交叉免疫保护，发病的情况仍然出现。因此此分离鉴定地方流行的血清型毒株，对其特性的研究来进行本地的防控。

（略）