杨 珍，郭林滚,单文杰，许 翔，熊亚坤，汪 娟，方 柳，罗庆华，邹雨妃，于士蒙，黄幸幸，刘克东，付戴波

（1.九江市畜牧兽医局 九江 332000；2.庐山市农业局；3.共青城市农林水务局；4.重庆市畜牧科学院）

应用16SrRNA技术快速检测一例雏鸡铜绿假单胞菌感染

杨 珍1，郭林滚2,单文杰3，许 翔1，熊亚坤1，汪 娟1，方 柳1，罗庆华4，邹雨妃1，于士蒙1，黄幸幸1，刘克东1，付戴波1

（1.九江市畜牧兽医局 九江 332000；2.庐山市农业局；3.共青城市农林水务局；4.重庆市畜牧科学院）

为快速诊断一例雏鸡死亡病因，本研究从病死雏鸡内脏分离获得一分离菌，运用分子生物学技术，快速扩增病原菌的16SrRNA基因，经测序获得一条长1439bp的16SrDNA序列，与GeneBank已知序列进行BLAST检索，结果表明该分离菌归类于假单胞菌属，应用生物信息学软件对目的基因进行分析，显示与铜绿假单胞菌高度相似，同源性高达99.9%，结合发病情况，初步判定为养殖场外环境消毒不严格，造成雏鸡铜绿假单胞菌感染。

雏鸡；铜绿假单胞菌；16SrRNA基因；分子进化树

0 引言

铜绿假单胞菌又称绿脓杆菌，位于变形菌纲——γ亚纲，假单胞菌科下的假单胞菌属，为革兰阴性菌，广泛分布于自然界，在水、空气、土壤等多处存在。铜绿假单胞菌多为条件致病菌，可引起鸡、鸭、鹌鹑、水貂、长臂猿、奶牛、大熊猫、袋鼠、蟒蛇等多种动物感染性疾病，多引起动物的呼吸道炎症、化脓性炎症、腹膜炎、关节炎、肠炎、子宫炎及肉芽肿等疾病[1-3]。

本研究针对重庆某鸡场育雏鸡发生大量死亡病例，对雏鸡的病料组织进行病原菌分离，应用16S rRNA技术进行快速鉴定，为临床快速防治该病提供参考。

1 发病情况

重庆某鸡场育雏鸡，接种马立克氏疫苗后3d，出现精神沉郁，食欲检测，随后相继批量死亡现象，发病率达到60%，死亡率约32%，怀疑马立克氏疫苗所致。

2 材料与方法

2.1 主要试剂

普通鲜血培养基由西南大学提供，基因组抽提试剂盒、PCR扩增试剂盒购于宝生物工程（大连）有限公司，PCR反应引物[4]由上海百力格生物技术有限公司合成（引物序列为F:5’-AGAGTTT⁃GATCCTGGCTCAG-3’，R:5’-GGTTACCTTGT⁃TACGACTT-3’）；DNA Marker、核酸染色剂、DNA纯化试剂盒等购于上海生工生物工程有限公司。

2.2 病原菌分离

剖解病死雏鸡，用接种针挑取心脏、肝脏、肺脏等组织表面黏液，接种于普通鲜血培养基，37℃培养18～24h，连续纯化后置于4℃冰箱保存，备用。

2.3 模板DNA提取

事先取50ul Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR（裂解液）置于灭菌的Micotube中。挑取4℃冰箱保存的分离菌于普通培养基上划线培养，18～24h后，用灭菌牙签或灭菌的枪头挑取单个菌落于Micotube中，搅拌混匀。80℃热变性15～20min，低速离心10min,取1～5μL上清液做扩增反应模板。

2.4 目的基因扩增

以基因组DNA为模板，用细菌16SrDNA的通用引物对PF/PR（序列对见2.1主要试剂），进行PCR扩增，目的片段预期大小约为1500bp，反应体系见表1、表2。

表1 反应扩增体系

表2 反应扩增程序

2.5 目的基因检测

取5μL PCR产物混合1μL 6×Loading Buffer进行1%琼脂糖凝胶电泳。加入DL2000 Marker作对照，在1～10V／cm凝胶电压下进行电泳35min。用凝胶成像系统观察并摄像记录结果。

将凝胶成像系统下，荧光效果良好PCR产物，进行10×Loading Buffer于1%琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，用PCR产物纯化试剂盒回收DNA（按照上海生工生物工程有限公司Gel Ex⁃traction Kit D2500-01胶回收试剂盒的指导说明进行），送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

2.6 生物信息学比对分析

运用NCBI网站的Blastn程序，将所测得的基因序列与GeneBank中已经注册的基因序列进行多序列同源性比对分析，结合生物信息学软件（DNAstar），运用邻接法（neighbor joining method）构建生物进化树。

3 试验结果

3.1 目的基因的电泳结果

利用细菌通用引物扩增细菌16SrRNA基因，琼脂糖凝胶电泳结果（见图1）显示该基因片段大小约1500bp，符合预期大小。

图1 16S rRNA基因电泳结果

3.2 目的基因测序结果

选择紫外荧光下亮度较强的产物进行胶回收纯化，将纯化的PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，得到一条长为1439bp的序列。

3.2 目的基因生物信息学分析

将目的片段序列提交至NCBI数据库，在线BLAST检索后，相似度最高的物种为铜绿假单胞菌，下载这些序列，鉴于相关报道提出恶臭假单胞菌与铜绿假单胞菌相似程度非常高，同时在GeneBank中选择2株亲缘关系接近的恶臭假单胞菌用作参照，利用软件生物信息学程序（DNA⁃STAR）进行同源性分析，结果显示分离株CQ-1与已知铜绿假单胞菌序列同源性最高达99.9%，与已知恶臭假单胞菌的同源性最高仅为94.5%。构建进化树可见分离株CQ-1与铜绿假单胞菌的进化距离更为接近（见图2、图3）。

图2 CQ-1 16SrRNA基因的同源性比较结果

图3 CQ-1 16SrRNA基因核苷酸序列构建进化树

4 分析及讨论

鸡养殖行业在国民经济中有着重要的地位，是我国畜牧业的支柱产业，也是规模化集约化程度最高，与国际先进水平最接近的产业。与此同时，鸡养殖行业也面临着来自病原微生物的巨大挑战，其中育雏期是养鸡生产中的基础阶段，育雏阶段的好坏直接影响禽群整个生长期的正常发育。育雏阶段禽免疫系统发育尚不完善，抗病能力低，在饲养管理条件不当的情况下极易受到病原微生物的入侵，引起大批死亡[5]。笔者建议养殖场要特别注意加强对育雏阶段雏鸡管理工作。

临床上引起人和动物发病的假单胞菌属主要为铜绿假单胞菌，而且目前相关报道也比较普遍，对动物养殖业生产带来了巨大经济损失。2012年齐静[6]等人从病死毛皮动物貂上分离出39株铜绿假单胞菌，2016年，孙鑫鹏[7]等人报道了一起铜绿假单胞菌造成50只獭兔死亡的病例。同样，铜绿假单胞菌对家禽业的影响也比较大，2007年张媛[8]等就从黄绿色鸡肉中分离到铜绿假单胞菌，2010～2011年部分地区也相继报到出铜绿假单胞菌引起育雏鸡死亡的病例[9-10]，与本研究情况较为相似，特别房海[9]等人的报道与本研究极为相似，均是在注射马立克氏病疫苗后出现死亡。

16SrRNA基因鉴定技术是从分子遗传进化及分子水平层面对病原菌进行鉴定，一方面使的兽医临床病原菌鉴定更加快捷，另一方面也使的病原菌的鉴定更为科学、准确[11]。由于16SrRNA基因进化非常缓慢，具有高度保守的特征，因此常用于标记生物间的进化距离及亲缘性，通常认为16SrRNA基因在98.8%以上就可算作同一个种[12]，本研究中分离菌与已知序列的相似性高达，因此可判断该分离菌为铜绿假单胞菌。

5 结论及建议

本研究从重庆某鸡场病死雏鸡分离到一株病原菌CQ-1，根据16SrRNA基因同源性分析可判定为铜绿假单胞菌。综合铜绿假单胞菌生物学特性及实际情况，判断感染与禽场环境及饲养器皿消毒不彻底有关，由于接种器械及接种部位的消毒不严格，为该致病菌传播创造了条件，建议该养鸡场做好饲养环境卫生管理及接种器械严格消毒工作。

[1]杨峻,罗青平,温国元等.湖北省地方鸡主要疾病流行病学调查[J].湖北农业科学,2013,(17)：4164-4166+4174

[2]曾纪锋,林杰材,李笑春等.蟒蛇铜绿假单胞菌的分离鉴定及抗药性分析[J].热带生物学报,2013,(02)：173-176.

[3]肖开提,阿曼古丽,施远翔等.奶牛铜绿假单胞杆菌的分离与鉴定[J].中国畜牧兽医,2007,(01)：49-50.

[4]Martin F Polz,Collen M Cavanaugh.Bias in template to product ratios in muhitemplate PCR[J].Appl Environ Microbiol,1998,64(10)：3724-3730.

[5]李玲,陈立功,魏昆鹏等.蛋鸡铜绿假单胞菌的分离鉴定及其耐药性和致病性研究[J].河北农业大学学报,2014,(03)：71-74.

[6]齐静,李云,刘远见等.山东荣成地区貂源铜绿假单胞菌的分离鉴定及抗药性分析[J].中国兽医杂志,2012,(09)：35-37.

[7]孙鑫鹏,高善颂,韩先杰.獭兔源铜绿假单胞菌的分离鉴定及药敏试验[J].动物医学进展,2016,(08)：128-131.

[8]张媛,陈小云,魏财文等.鸡源铜绿假单胞菌的分离、鉴定及其杀灭试验[J].中国兽药杂志,2007,(03)：14-17.

[9]房海,陈翠珍,史秋梅等.雏鸡铜绿假单胞菌的分离鉴定及生物学特性分析[J].畜牧与兽医,2010,(05)：71-74.

[10]卢受昇,孔令辰,罗晶璐等.一例雏鸡铜绿假单胞菌的分离鉴定及其16SrRNA基因序列分析[J].广东畜牧兽医科技,2011,(06)：32-35.

[11]李玲.鸡铜绿假单胞菌的分离鉴定及生物学特性研究[D].河北：河北农业大学,2013,30-31.

[12]韩文瑜,冯书章.现代分子病原细菌学[M].长春：吉林科学技术出版社,2003.

S851.34+7.2

A

1008-6137（2017）05-0011-04

2017-09-12.