程书波 张永美

(1.河南理工大学安全与应急管理研究中心，河南 焦作 454000；2.河南理工大学应急管理学院，河南 焦作 454000)

ZnO纳米材料对污泥厌氧发酵产氢的影响及其机理研究*

程书波1，2张永美1，2

(1.河南理工大学安全与应急管理研究中心，河南 焦作 454000；2.河南理工大学应急管理学院，河南 焦作 454000)

在序批式反应器中探究了ZnO纳米材料(ZnONP)对污泥厌氧发酵产氢的影响及其影响机理。结果表明：与空白组相比，5mg/LZnONP对污泥厌氧发酵产氢影响不明显，而120mg/LZnONP能抑制污泥厌氧发酵产氢，并且氢气产量是空白组的23.4%；高浓度ZnONP能抑制溶解性蛋白质和多糖的溶出，并能严重抑制蛋白酶、α-葡萄糖苷酶和氢化酶活。

ZnO纳米材料 厌氧发酵 产氢 剩余污泥

生物脱氮除磷技术由于能有效去除水体中的氮磷元素而遏制了水体富营养化，进而被广泛应用于污水处理厂[1]。但该技术有一个缺点，即产生大量的剩余污泥[2]。剩余污泥中含有大量的重金属、有机污染物及病原体等，若得不到有效地处理与处置会造成环境的二次污染。另一方面，随着石油等能源物质的消耗会造成温室效应，而氢气燃烧产物只有水而被认定为理想的能源物质[3]。近年来，因为利用剩余污泥厌氧发酵产氢一方面可实现剩余污泥的处理与处置，另一方面能回收能源物质氢气[4]，所以该技术逐步得到有关学者的关注。

随着纳米技术的不断发展，纳米材料也被应用在涂料、催化剂等工业产品中，ZnO纳米材料(ZnO NP)由于其特有的属性而被广泛的重视[5]。含有ZnO NP的物质在使用过程会造成大量ZnO NP的释放，最终随水体进入污水处理厂，进而干扰生物脱氮除磷和污泥的厌氧处理[6]。MU等[7]报道，ZnO NP能降低产甲烷关键酶F420的酶活，进而导致甲烷产量下降。污泥厌氧发酵产氢与厌氧产甲烷是不同的生化反应，其参与的功能菌种也不同，然而ZnO NP对污泥厌氧发酵产氢的影响至今尚未报道。本研究重点探究了ZnO NP对污泥厌氧发酵产氢的影响，并进一步探究了ZnO NP对污泥厌氧发酵产氢的影响机理。

1 材料与方法

1.1 ZnO NP与污泥

ZnO NP购买于当地某生物制药公司，其基本粒径为120 nm。

剩余污泥取自当地污水处理厂的二沉池，取回后在实验室经过1 mm×1 mm的滤筛后静置24 h，去掉上清液备用。基本性质如下：pH 6.8，总悬浮固体(TSS)12 600 mg/L，挥发性悬浮固体(VSS)10 240 mg/L，溶解性COD(SCOD)120 mg/L，总COD 13 520 mg/L，总蛋白质(以COD量计)8 240 mg/L，总糖(以COD量计)1 350 mg/L。

1.2 ZnO NP对污泥厌氧发酵产氢的影响

本实验在5个序批式反应器中进行，每个反应器中污泥量为800 mL。为探究ZnO NP对污泥厌氧发酵产氢的影响，反应器中的产甲烷菌活性应被抑制，因此通过严格控制pH=10.0来抑制产甲烷菌的活性。不同剂量的ZnO NP投加至反应器中使得ZnO NP质量浓度分别为0、5、30、60、120 mg/L。本实验没有额外接种物质的添加，因此剩余污泥既起到接种物的作用又起到发酵基质的作用。最后，向反应器中充入5 min高纯氮气排掉反应器中内部空气，然后密封，放置在转速为120 r/min的摇床上，摇床的温度控制在35 ℃。

1.3 测定方法

pH采用PHS-3E雷磁pH计测定。COD根据《水质 化学需氧量的测定 重铬酸盐法》(GB 11914—89)测定。总蛋白质采用凯氏定氮法[8]测定。溶解性蛋白质采用福林酚法[9]测定。总糖采用蒽酮比色法[10]测定。溶解性多糖采用苯酚-硫酸法[11]测定。VSS、TSS、SCOD根据文献[12、13]测定。氢气和挥发性脂肪酸(VFA，主要包含乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸和异戊酸)采用气相色谱法[14]测定。气相色谱配有热检测器、不锈钢填充柱，进样口、填充柱和检测器的温度分别控制在40、40、80 ℃，氮气作为载气，且流速为30 mL/min。

2 结果与讨论

2.1 ZnO NP对污泥厌氧发酵产氢的影响

由图1可知，空白组(0 mg/L)中氢气产量呈现先上升后维持不变的趋势，148 h时氢气产量稳定为26.5 mL/g。这主要是强碱性环境能抑制产甲烷菌的活性，进而减少氢气的消耗。当ZnO NP质量浓度为5 mg/L时，氢气最大产量为25.8 mL/g，与空白组相差不明显；当ZnO NP质量浓度为30 mg/L时，氢气产量受到严重的抑制，最大产量为14.9 mL/g，是空白组的56.2%；进一步提高ZnO NP浓度，氢气最大产量也进一步被抑制，当ZnO NP质量浓度为120 mg/L时，氢气最大产量仅为6.2 mL/g，是空白组的23.4%。表明低浓度的ZnO NP对污泥厌氧发酵产氢影响不明显，而高浓度的ZnO NP却能严重抑制污泥厌氧发酵产氢。

注：氢气产量以单位VSS量计。图1 ZnO NP对污泥厌氧发酵产氢的影响Fig.1 Effect of ZnO NP on the production of hydrogen from anaerobic fermentation of sludge

2.2 ZnO NP抑制污泥厌氧发酵产氢的机理

在机理研究中，本研究重点研究了0、5、120 mg/L的ZnO NP对污泥厌氧发酵产氢的影响。由图2可知， 5mg/L ZnO NP作用下污泥外观与空白组相差不明显，然而当ZnO NP质量浓度提高到120 mg/L时，污泥表面被严重破坏。

图2 不同ZnO NP质量浓度下污泥的电子扫描图Fig.2 Scanning electron micrographs imaging of sludge exposed to different mass concentrations of ZnO NP

污泥厌氧发酵产氢是生物作用，厌氧微生物要想利用污泥内的有机质首先要实现胞内物质的释放[15]。由图3可见，溶解性蛋白质和多糖均随着时间而呈现上升的趋势。与空白组相比，5 mg/L ZnO NP作用下溶解性蛋白质和多糖相差均不明显；当ZnO NP质量浓度为120 mg/L时，溶解性蛋白质和多糖严重被抑制，24 h时分别为89、26 mg/L，分别是空白组的53%和50%。溶解性物质的释放是后续产氢的发酵基质，高浓度ZnO NP能严重抑制溶解性物质的释放，这也是导致高浓度ZnO NP抑制污泥厌氧发酵产氢的原因之一。

图3 ZnO NP对溶解性蛋白质和多糖的影响Fig.3 Effect of ZnO NP on soluble protein and carbohydrate

生物产氢主要发生在酸化阶段，酸化类型也会影响氢气产量。由图4可见，乙酸和丙酸浓度最大，随后是异丁酸。在之前报道中，乙酸和丁酸含量较大有助于氢气产生，而丙酸的生成不易于氢气的生成[16-17]。空白组中丙酸占21%，而120 mg/L ZnO NP作用下则升高到28%，丙酸含量的提高能抑制产氢微生物的活性。

注：VFA各组分质量浓度以单位VSS量产生的COD量计。图4 ZnO NP对VFA各组分质量浓度的影响(氢气最大产量时)Fig.4 Effect of ZnO NP on individual VFA mass concentrations (maximum hydrogen yield)

污泥厌氧发酵产氢是一种生化反应，这其中有关键酶的调控。本研究中pH控制在10.0，产甲烷菌活性被严重抑制，因此重点测试了水解和产氢酶活。蛋白酶和α-葡萄糖苷酶分别对蛋白质和多糖的分解起主要作用[18-19]。氢化酶是生物产氢过程中的关键酶。由图5可见，5 mg/L ZnO NP作用下蛋白质、α-葡萄糖苷酶及氢化酶的相对酶活与空白组相差均不明显；当ZnO NP质量浓度升高到120 mg/L时，蛋白酶、α-葡萄糖苷酶和氢化酶的相对酶活分别是空白组的56%、48%、49%，说明高浓度ZnO NP严重抑制了水解和产氢关键酶活。这也与高浓度ZnO NP作用下溶解性蛋白质及多糖含量显著小于空白组相对应。

图5 ZnO NP对关键酶活的影响(氢气最大产量时)Fig.5 Effect of ZnO NP on the activities of key enzymes responsible (maximum hydrogen yield)

此外，同样探究了ZnO NP对产酸关键酶的影响，乙酸激酶与乙酸的形成有密切关系，而草酰乙酸转羧化酶与丙酸的形成有密切关系。由图5可知，5 mg/L ZnO NP对乙酸激酶和草酰乙酸转羧化酶的影响不大，而120 mg/L ZnO NP则具有严重的抑制作用，也与图4结果一致。

3 结 论

氢气产量与ZnO NP浓度相关，即低浓度ZnO NP对污泥厌氧发酵产氢的影响不明显，而120 mg/L ZnO NP作用下污泥的氢气产量仅为空白组的23.4%。低浓度ZnO NP对污泥的水解、产酸和产氢关键酶活影响不明显，而高浓度ZnO NP却能抑制污泥中溶解性蛋白质和多糖的溶出，并严重抑制了污泥厌氧发酵产氢。

[1] APPELS L，BAEYENS J，DEGRVE J，et al.Principles and potential of the anaerobic digestion of waste-activated sludge[J].Progress in Energy and Combustion Science，2008，34(6)：755-781.

[2] KELESSIDIS A，STASINAKIS A S.Comparative study of the methods used for treatment and final disposal of sewage sludge in European countries[J].Waste Management，2012，32(6)：1186-1195.

[3] GHIMIRE A，FRUNZO L，PIROZZI F，et al.A review on dark fermentative biohydrogen production from organic biomass：process parameters and use of by-products[J].Applied Energy，2015，144(3)：73-95.

[4] WANG D B，ZENG G M，CHEN Y G，et al.Effect of polyhydroxyalkanoates on dark fermentative hydrogen production from waste activated sludge[J].Water Research，2015，73(6)：311-322.

[5] ELLSWORTH D K，VERHULST D，SPITLER T M，et al.Titanium nanoparticles move to the marketplace[J].Chemical Innovation，2000，30(12)：30-35.

[6] ZHENG X，WU R，CHEN Y G.Effects of ZnO nanoparticles on wastewater biological nitrogen and phosphorus removal[J].Environmental Science & Technology，2011，45(7)：2826-2832.

[7] MU H，CHEN Y G.Long-term effect of ZnO nanoparticles on waste activated sludge anaerobic digestion[J].Water Research，2011，45(17)：5612-5620.

[8] BRADSTREET R B.Kjeldahl method for organic nitrogen[J].Analytical Chemistry，1954，26(1)：185-187.

[9] PRIOR R L，WU X，SCHAICH K.Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53(10)：4290-4302.

[10] DUBOIS M，GILLES K，HAMILTON J K，et al.A colorimetric method for the determination of sugars[J].Nature，1951，168(4265)：167.

[11] MASUKO T，MINAMI A，IWASAKI N，et al.Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format[J].Analytical Biochemistry，2005，339(1)：69-72.

[12] 黄天寅，巫华，吴玮，等.pH值对污泥发酵产酸的影响[J].环境工程学报，2013，7(1)：329-332.

[13] MENG Y，MUMME J，XU H，et al.A biologically inspired variable-pH strategy for enhancing short-chain fatty acids (SCFAs) accumulation in maize straw fermentation[J].Bioresource Technology，2016，201(4)：329-336.

[14] LUO J Y，FENG L Y，CHEN Y G，et al.Stimulating short-chain fatty acids production from waste activated sludge by nano zero-valent iron[J].Journal of Biotechnology，2014，187(8)：98-105.

[15] ZHAO Y X，CHEN Y G，ZHANG D，et al.Waste activated sludge fermentation for hydrogen production enhanced by anaerobic process improvement and acetobacteria inhibition：the role of fermentation pH[J].Environmental Science & Technology，2010，44(9)：3317-3323.

[16] 蔡木林，刘俊新.污泥厌氧发酵产氢的影响因素[J].环境科学，2005，26(2)：98-101.

[17] KHANAL S K，CHEN W H，LI L，et al.Biological hydrogen production：effects of pH and intermediate products[J].International Journal of Hydrogen Energy，2004，29(11)：1123-1131.

[18] LI J，ZHENG G，HE J，et al.Hydrogen-producing capability of anaerobic activated sludge in three types of fermentations in a continuous stirred-tank reactor[J].Biotechnology Advances，2009，27(5)：573-577.

[19] FENG L Y，CHEN Y G，ZHENG X.Enhancement of waste activated sludge protein conversion and volatile fatty acids accumulation during waste activated sludge anaerobic fermentation by carbohydrate substrate addition：the effect of pH[J].Environmental Science & Technology，2009，43(12)：4373-4380.

ResearchontheeffectandmechanismofnewpollutantZnOnanophaseonhydrogenproductionfromanaerobicfermentationofsludge

CHENGShubo1，2，ZHANGYongmei1，2.

(1.SafetyandEmergencyResearchCenter，HenanPolytechnicUniversity，JiaozuoHenan454000；2.EmergencyManagementSchool，HenanPolytechnicUniversity，JiaozuoHenan454000)

The impact of ZnO nanophase (ZnO NP) on hydrogen production from anaerobic fermentation of waste activated sludge in sequencing batch reactor was explored. Experimental results showed 5 mg/L ZnO NP caused insignificant influence on hydrogen production as compared with that in blank，however，120 mg/L ZnO NP seriously inhibited hydrogen production from sludge fermentation，and the hydrogen production was 23.4% of that in blank. High levels of ZnO NP inhibited the release of soluble protein and carbohydrate and seriously inhibited the activities of protease，α-glucosidase and hydrogenase.

ZnO nanophase； anaerobic fermentation; hydrogen production; waste activated sludge

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.10.002

程书波，男，1979年生，博士，副教授，研究方向为固废资源化处理、水污染控制工程。

*国家自然科学基金资助项目(No.41101460)。

2016-07-13)