郭凤英　李培锋　贾俊涛

摘要：为研究牛磺胆酸（TCA）对体外培养小鼠胸腺细胞凋亡的影响，探讨其免疫调节作用，采用梯度离心法分离获取小鼠胸腺细胞，37 ℃培养12 h后与不同浓度TCA共孵12 h。以流式细胞术对原代培养胸腺细胞早期凋亡进行定量检测；应用分光光度法检测了凋亡特异性蛋白酶Caspase-9、Caspase-3活性的变化。结果表明，TCA3组（终浓度为0.30 μg/mL）与胸腺细胞共孵12 h后，可极显著抑制磷脂酰丝氨酸外翻，抑制细胞凋亡，TCA2组（终浓度为0.15 μg/mL）可显著提高Caspase-9、Caspase-3活性，诱导细胞凋亡。说明TCA通过对体外培养小鼠胸腺细胞凋亡的调节作用来调节机体免疫功能。

关键词：牛磺胆酸；细胞凋亡；免疫调节

中图分类号：R965 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）19-3706-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.19.026

Abstract： In this paper the study was aimed at discussing the immunoregulation of taurocholic acid（TCA） by analyzing its effects on mice thymocyte apoptosis. The mice thymocyte cells were isolated by gradient centrifugation and cultured under 37 ℃ with TCA of different concentration for 12 hours. Through flow cytometry（FCM），the thymocyte apoptosis in early stage were detected quantitatively. Besides，the activity of caspase-9 and caspase-3 were detected through spectrophotometric methods. The results showed that the TCA group 3（the final concentration：0.3 μg/mL） could dramatically restrain phosphatidylserine from eversion and restrain the cells apoptosis. Meanwhile，TCA group 2（the final concentration：0.15 μg/mL） could greatly improve the activity of caspase-9 and caspase-3，and induce the cells apoptosis. It indicated that TCA adjusts organism immune function by regulating the mice thymocyte apoptosis.

Key words： taurocholic acid （TCA）； mice thymocyte apoptosis； immune regulation

胆汁在中国医药上的应用历史悠久[1]。大量的药理实验表明，动物胆汁的主要药理作用是由胆酸盐和胆汁酸发挥的。牛磺胆酸（Taurocholic acid，TCA）是牛羊胆汁中的主要有效成分之一。研究表明TCA具有镇咳、祛痰、平喘、抗炎作用，对心脏和血压也具有一定的影响[2-4]。据报道[5]，TCA对机体免疫细胞功能具有调节作用。免疫细胞的凋亡在免疫系统的自稳中极为重要，已成为当今免疫学研究的一个热点。本试验采用流式细胞等技术，研究不同浓度TCA对原代培养小鼠胸腺细胞凋亡的影响，探讨TCA对机体免疫功能的调节作用，从而为TCA的临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 清洁级纯种昆明小白鼠，体重（20±2） g，雌雄各半，由内蒙古大学实验动物研究中心提供。

1.1.2 药品与试剂 牛磺胆酸，实验室自制，纯度达97%以上；淋巴细胞分离液，天津灏洋生物制品科技有限责任公司，批号LTS1077； Caspase-3分光光度法检测试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司，货号KGA-203；Caspase-9分光光度法检测试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司，货号KGA-403；Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司，货号KGA-102。

1.1.3 主要仪器 酶标仪（ELX800，BIO-TEKINSTUMENTS）；超净工作台（FLC-3，哈尔滨东联公司）；流式细胞仪（FACSCalibur，美国BD公司）；CO2培养箱（SERIE SⅡ，Forma Scientific，Inc.）。

1.1.4 數据处理 试验结果采用x±s表示，用SAS 9.0软件处理数据，两样本比较采用t检验，样本组间差异比较采用F检验。

1.2 方法

1.2.1 胸腺细胞的获取 眼球放血处死后，75%乙醇浸泡2 min，无菌分离胸腺，去除小血管及结缔组织，置于4 ℃培养液（含RPMI-1640培养基，5%灭活小牛血清，谷氨酞胺2 mmol/L，青霉素100 U/mL，链霉素0.2 mg/mL）中，在250目筛网轻轻研磨，离心（1 500 r/min，4 min），洗涤2次，重悬细胞于含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液中，计数并且调整细胞数至2×106个/mL，置于24孔细胞培养板并使每孔终体积为1 mL，于5% CO2孵育箱中37 ℃培养12 h。

1.2.2 试验分组及处理 试验动物随机分为4组，每组5只，即空白对照组（胸腺细胞仅在完全培养基内培养）；TCA 1组（TCA终浓度为0.03 μg/mL，与胸腺细胞共同孵育12 h）；TCA2组（TCA终浓度为0.15 μg/mL，与胸腺细胞共同孵育12 h）；TCA3组（TCA终浓度为0.30 μg/mL，与胸腺细胞共同孵育12 h）。

1.2.3 胸腺细胞早期凋亡的检测 采用流式细胞术Annexin V-PI双染色法[6]，检测TCA与胸腺细胞共孵育后凋亡早期磷脂酰丝氨酸外翻情况，进而反映细胞早期凋亡百分率。

1.2.4 Caspase-9的活化程度的检测 按常规方法制备胸腺细胞。将培养得到的胸腺细胞用PBS洗涤二遍（2 000 r/min，离心5 min）。按照试剂盒要求进行操作。最后用酶标仪在405 nm处测定其吸光度[7]。

1.2.5 Caspase-3的活化程度的检测 方法同1.2.4。

2 结果与分析

2.1 TCA对胸腺细胞早期凋亡的影响

由表1可见，不同浓度TCA与胸腺细胞共同孵育后，均能显著抑制胸腺细胞凋亡（P<0.05），以TCA3组的抑制效果最好。

2.2 TCA对Caspase-9活化程度的影响

由表2可见，不同浓度TCA与胸腺细胞共同孵育后，TCA2组、TCA3组均可显著诱导胸腺细胞凋亡（P<0.05），TCA1组则无明显影响（P>0.05）。

2.3 TCA对Caspase-3活化程度的影响

由表3可见，不同浓度TCA与胸腺细胞共同孵育后，TCA2组可显著诱导胸腺细胞凋亡（P<0.05），而TCA1、TCA3组则无明显影响（P>0.05）。

3 小结与讨论

研究发现，当细胞凋亡启动之初，分布于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）暴露于细胞膜外，利用该特性可定量检测早期凋亡细胞[8]。试验结果显示，高剂量TCA可显著抑制胸腺细胞磷脂酰丝氨酸的外翻，显著降低细胞凋亡百分率。由此表明，TCA抑制胸腺细胞磷脂酰丝氨酸外翻，阻止胸腺细胞的早期凋亡是通过其直接作用实现的。由于胸腺是T细胞分化、成熟的场所，在T细胞的分化和调节中起重要的作用[9，10]。因而提示，TCA可通过抑制胸腺细胞凋亡启动阶段，促进机体T细胞的应答反应，调节机体免疫。

Caspase是一类凋亡特异性蛋白酶，分为启动Caspase（如Caspase-9）和效应Caspase（如Caspase-3）两类，参与凋亡的启动和执行过程，它们的活化是细胞凋亡过程中的关键[11]。活化的Caspase-9引发Caspase级联反应，激活Caspase-3，其作为效应子，作用于不同的靶分子，经蛋白水解作用使细胞凋亡。试验证实，TCA可显著提高凋亡特异性蛋白酶Caspase-9、Caspase-3的活性，促进胸腺细胞凋亡。这一结果表明TCA诱导胸腺细胞凋亡，该作用可能与上调胸腺细胞中Caspase-9、Caspase-3的表達有关。

细胞凋亡（apotosis）在胚胎发育、组织发生、胸腺细胞的选择等方面起着重要的作用。通过细胞凋亡机制的胸腺细胞阴性选择，使大量未成熟的细胞包括自身反应性T细胞得到清除，从而保持正常免疫功能状态。试验结果显示，在胸腺细胞发生凋亡早期时，TCA可抑制其发生凋亡，使胸腺细胞分化增殖，参与免疫反应。但随着免疫反应进行到一定阶段，也即胸腺细胞分化增殖到一定数量时，TCA 就开始诱导其凋亡，使免疫细胞维持在一定的数量水平而保证免疫反应有序地进行，从而使机体免疫系统保持稳态。由此可知，免疫细胞对早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的反应是截然不同的。综上所述，TCA通过对不同阶段胸腺细胞凋亡产生诱导或抑制作用，调节机体的免疫反应。

参考文献：

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