冯丽，冯菊红，胡学雷

(武汉工程大学化工与制药学院，湖北 武汉430074)

HPLC法测定恩杂鲁胺原料药的含量

冯丽，冯菊红，胡学雷

(武汉工程大学化工与制药学院，湖北 武汉430074)

为建立HPLC法测定恩杂鲁胺原料药的含量,采用Ultimate LP-C18(250×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以甲醇-0.1%磷酸二氢钾溶液(70∶30)为流动相，流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL.结果表明，恩杂鲁胺的浓度在12-52 μg/mL范围内与峰面积呈现良好的线性关系(r=0.999 2)，平均回收率为99.18%-100.10%(n=3)，RSD为0.4%-0.5%.本法具有分析速度快、简单、准确以及专属性强好等特点，适合恩杂鲁胺含量的测定.

恩杂鲁胺；高效液相色谱法；外标法

0 引言

恩杂鲁胺(英文名：enzalutamide，商品名：Xtandi)是第二代雄激素受体抑制剂，用于治疗去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer，CRPC)[1]，由Medivation公司和Astellas公司共同研发，该药于2012年8月获美国食品药品监督管理局(USA, Food and Drug Administration，FDA)批准上市，2014年成为英国国立临床疗效研究所(The National Institute for Health and Care Excellence，NICE))最终指南的推荐用药.它通过以下3种途径阻断雄激素受体的信号传导:竞争性地结合雄激素受体；抑制雄激素受体核转移；抑制雄激素受体及雄激素受体协同蛋白与DNA发生作用[2].相较于第一代雄激素受体抑制剂比卡鲁胺，恩杂鲁胺靶向活性更高、副作用更小、安全性更高，有望成为第二代最佳雄激素受体抑制剂.它的使用有效地改善了患者的生活质量并延长了患者的总生存期，给广大CPRC患者带来了福音.文献[3-7]报道了恩杂鲁胺的合成方法，但关于恩杂鲁胺原料药的含量测定方法鲜有报道，美国药典2016版(USP39)亦未收载.本文中建立HPLC法测定恩杂鲁胺原料药的含量，可为恩杂鲁胺的质量控制及后续制剂研究提供依据.

1 仪器与试剂

1.1仪器PL-S型电子天平(梅特勒-托利多仪器公司)；UltimateMate3000高效液相色谱仪(美国塞默飞公司)；SCQ-250型超声波清洗器(上海申波超声公司)；SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海荣升化仪器厂).

1.2试剂恩杂鲁胺标准品(纯度为99.80%，上海芷威化学科技有限公司)，恩杂鲁胺供试品(批号分别为20160601、20160610和20160620，均由实验室自制)，甲醇(色谱纯，国药集团试剂有限公司)，双蒸水(自制)，其他的试剂均为分析纯.

2 方法与结果

2.1色谱条件采用塞默飞UltimateMate3000型高效液相色谱仪，UV200Ⅱ型紫外检测器，色谱柱为Ultimate LP-C18(250×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.1%磷酸二氢钾溶液(70:30)，检测波长为244 nm，流速为1.0 mL/min，柱温25 ℃，进样量10 μL.

2.2标准品溶液和供试品溶液的配制精密称取干燥至恒重的恩杂鲁胺标准品100.2 mg(相当于恩杂鲁胺100 mg)，置于100 mL容量瓶中，加甲醇25 mL超声溶解并加入流动相定容至刻度，精密量取5 mL，加入流动相稀释至25 mL，摇匀，作为标准品溶液备用.另精密称取干燥至恒重的恩杂鲁胺供试品20 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇10mL超声溶解，再加入流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液备用.

2.3系统适应性试验取空白溶剂(流动相)以及“2.2”项下经稀释的标准品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图(如图1).结果表明，空白溶剂对恩杂鲁胺的检测无干扰，恩杂鲁胺主峰与杂质峰完全分离(分离度R>1.5)且主峰保留时间为5.24 min.

图1 系统适应性实验A：空白溶剂的HPLC色谱图；B：恩杂鲁胺标准品的HPLC色谱图；C：恩杂鲁胺供试品的HPLC色谱图

图2 恩杂鲁胺的标准曲线

2.4标准曲线的绘制精密移取标准品溶液1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5 mL，分别加流动相稀释至25 mL，混匀，作为系列线性溶液.然后按照“2.1”项色谱条件依次进样检测，以峰面积A对浓度C进行线性回归(如图2)，得到回归方程A=2.698×102+110.4C，r=0.999 2(n=6)，表明恩杂鲁胺的浓度在12-52 μg/mL范围内与峰面积线性相关.

2.5回收率实验取已知含量的恩杂鲁胺样品适量，按照“2.2”项下的方法，配制99.7 μg/mL的供试品溶液，精密移取5 mL，平行9份，分为3组，分别置于50 mL的容量瓶中.另外按照同样的方法配制99.8 μg/mL恩杂鲁胺标准品溶液，精密量取8 mL、10 mL、12 mL分别加入到上述3组容量瓶内，用流动相定容，摇匀.按照“2.1”项色谱条件进样，结果见表1，低、中、高3种浓度的平均回收率分别是99.18%、099.33%、100.10%，RSD分别是0.5%、0.4%、0.4%(n=3)，说明该种方法的回收率良好.

表1 恩杂鲁胺的回收率(n=3)

2.6精密度实验取恩杂鲁胺标准品适量，精密称定，加甲醇溶解并加入流动相稀释至24 μg/mL，依照“2.1”项色谱条件，连续进样6次，记录色谱图.计算得恩杂鲁胺峰面积RSD=0.9%(n=6)，表明本方法精密度良好.

2.7重复性实验称取5份恩杂鲁胺(20160601批)供试品，用甲醇溶解，加入流动相定容，配制成40 μg/mL的溶液，按照“2.1”项色谱条件进样，记录色谱图.结果恩杂鲁胺峰面积RSD为0.6%(n=5)，表明本方法重复性良好.

2.8稳定性实验精密的称取恩杂鲁胺标准品适量，用甲醇溶解，加入流动相定容至 28 μg/mL，按照“2.1”项色谱条件，于0、2、4、6、8 h分别进样检测，记录恩杂鲁胺的峰面积，得RSD=0.9%(n=5)，表明恩杂鲁胺溶液在8 h内是稳定的.

2.9恩杂鲁胺含量测定精密称取各批次恩杂鲁胺供试品适量，按照“2.2”项方法制成44 μg/mL(按质量计)的供试品溶液；另取适量恩杂鲁胺标准品，按照同样的方法配制相同浓度的标准品溶液.分别按“2.1”项色谱条件进样，记录主峰面积，按外标法以峰面积计算供试品的含量(结果见表2).

表2 样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

3.1波长的选择将恩杂鲁胺标准品溶液在200-400 nm的波长范围内扫描，其在244 nm处有最大吸收，且空白溶剂在此处对样品测定无干扰，故选择244 nm作为为检测波长.

3.2流动相的选择实验曾采用甲醇:水/(体积比V甲醇∶V水=50∶50)作为流动相，结果主峰保留时间过长.逐渐调整流动相的比例直至V甲醇∶V水=70∶30，主峰保留时间适宜，但此时有拖尾现象.随后在流动相中加入磷酸二氢钾，拖尾现象消失.流动相中添加缓冲盐后，离子强度增加，干扰了恩杂鲁胺结构中的胺类极性基团与C18柱上残存的硅羟基的相互作用，从而改善峰形.

3.3柱温的选择实验采用25、30、35 ℃ 3组不同的柱温条件进样对照，温度升高，样品出峰时间缩短，但是对样品的分离效果以及样品的含量测定无明显影响，故最终选择25 ℃作为柱温.

3.4流速的选择样品以0.8、1.0、1.2 mL/min的速度分别进样.流速增大，主峰宽度变窄，峰面积变小，但是主峰与杂质峰均可分离.综合考虑到流速对峰形及色谱柱和液相系统压力的影响，最终选择1.0 mL/min作为流速.

4 结论

恩杂鲁胺作为一种新型的前列腺癌治疗药物，具有良好的临床疗效以及巨大市场开发潜力，其相关研究已经引起了广大药物研发工作者的重大关注.本文中采用HPLC法测定恩杂鲁胺原料药的含量，分析速度快、灵敏度高、专属性强、结果准确可靠，不仅可以用于产品的质量控制，也可以为产品的相关研究提供科学的分析方法，为后续的开发与验证作出了有益的探索.

[1] Charles L S，Michael E J，Charlie D C，et al.Diarylhydantoin Compounds:US，7709517[P].2010-05-04.

[2] Peddy V，Boge R，Madivada L R.Enzalutamide polymorphic forms and its preparation:WO2014041487A2[P].2014-03-20.

[3] Sawyers C，Jung M，Chen C，et al.Diarylhydantoin compounds:WO，2006124118[P].2006-11-23.

[4] 宋丽君，王飏，李志裕，等.雄激素受体拮抗剂MDV3100的合成研究[J].精细化工中间体，2012，42(1):34-36.

[5] 谢文成.雄激素受体拮抗剂MDV3100的合成研究[D].济南:山东大学药学院，2014.

[6] Douglas A L，Sanjay K，Randy J W，et al.Formulations of Enzalutamide:US2014179749[P].2014-07-26.

[7] 曾令康，冯菊红，葛燕丽，等.抗前列腺癌药恩杂鲁胺的研究进展[J].武汉工程大学学报，2015，37(9):11-17.

DeterminationofenzalutamidecrudedrugbyHPLC

FENG Li，FENG Juhong，HU Xuelei

(School of Chemical Engineering and Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China)

To establish an HPLC method for the determination of the content of enzalutamide crude drug.Ultimate LP-C18 column(250×4.6 mm，5 μm)was used.The mobile phase was methonal-0.1% potassium dihydrogen phosphate solution(70∶30).The flow rate was 1.0 mL·min-1.The injection volume was 10 μL.The results showed that there was good linearity of enzalutamide in the range of 12—52 μg/mL(r=0.999 2).The average recovery was 99.18%—100.10%(n=3)，andRSDwas 0.4%—0.5%.The method was rapid，simple，accurate and specific for the content determination of enzalutamide.

enzalutamide；HPLC；external standard method

2017-02-02

湖北省自然科学基金重点项目(2011CDA048)资助

冯丽(1991-)，女，硕士生；冯菊红，通信作者，讲师，E-mail：jhfeng@wit.edu.cn

1000-2375(2017)06-0673-04

R917

A

10.3969/j.issn.1000-2375.2017.06.020

(责任编辑 胡小洋)