汪声晨，周玉玲，张桂敏

(湖北大学生命科学学院，湖北 武汉 430062)

消毒型洗衣液对淀粉酶、纤维素酶酶活影响的研究

汪声晨，周玉玲，张桂敏

(湖北大学生命科学学院，湖北 武汉 430062)

衣物上常见的淀粉类污垢有巧克力、土豆泥、面条、粥等，加入淀粉酶的洗衣液对去除这类污垢效果良好；另外织物表面因多次洗涤而在主纤维上出现微毛和小绒球，纤维素酶可将主纤维上的微毛和绒球除去，从而使主纤维变得光滑柔软，并具有增白效果. 本实验选取革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的两种代表菌 (藤黄八叠球菌和大肠杆菌)，通过牛津杯法测定消毒型洗衣液对上述两种菌的抑菌效果. 结果显示，该消毒型洗衣液对藤黄八叠球菌(革兰氏阳性菌)有抑菌效果，而对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)无抑菌作用. 同时，以中温淀粉酶和中温纤维素酶样品作为研究对象，通过DNS法测定加入洗衣液前后相应酶的活力，结果显示加入1%洗衣液后淀粉酶的活力降低32.8%，纤维素酶的活力降低5.4%，这说明消毒型洗衣液中的成分对上述两种酶的活力有一定的影响，从而影响酶在洗涤方面的应用.

淀粉酶；纤维素酶；洗衣液；抑菌效果；3, 5-二硝基水杨酸；酶活

0 引言

传统的合成洗涤剂中包括表面活性剂、三聚磷酸钠、硫酸钠、荧光增白剂和其他助剂等组分. 其配方虽具有较高的稳定性，但在自然界中会产生累积效应，加重环境负荷，尤其是含磷洗涤剂会加剧封闭水体的富营养化，污染环境[1].为降低环境污染，提高衣物的洗涤效果，新一代洗涤剂在减少三聚磷酸钠、荧光增白剂等助剂的同时，添加了酶制剂. 酶制剂的自然降解性较强且内在毒性较低，这一优点使得加酶洗涤剂所产生的洗涤废水要远远少于传统洗涤剂. 因此，与普通洗涤剂相比，加酶洗涤剂以其去污效率高、去污效果显著、性价比高等突出优点，在洗涤剂工业中受到高度重视. 与此同时，酶的引入使洗涤剂的性能提高到一个新的高度，促进了重垢液洗的发展.

目前已大规模应用于洗涤剂工业的酶制剂主要有蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶等2]. 有研究结果表明，在洗涤剂中加入蛋白酶, 可有效清除人体皮肤产生的皮脂、衍生蛋白质和食物残留物等, 其作用是使污垢容易从织物上清洗下来. 但有时在与皮肤接触较多的内衣领口、袖口上的污垢不仅附着在纤维表面, 而且还进入纤维内部组织. 电镜观察结果表明, 这是织物泛黄的主要原因. 如果在洗涤剂中加入少量纤维素酶, 可使棉织物的纤维素结构膨松, 纤维分子与水形成的凝胶结构被有效地软化, 使封闭在其中的污垢易从纤维缝隙间流出, 从而提高去污力, 且洗后织物因去掉棉纤维浮毛而色泽鲜艳、柔软光滑[3-5].

然而，有些洗涤用品为了突出洗涤剂的消毒功能，在洗涤剂中同时加入了消毒剂，希望不但洗涤效果好，还能杀菌. 目前常用的消毒剂有广谱杀菌剂如环氧乙烷、过氧乙酸、甲醛、戊二醛、含氯消毒剂(漂白粉、三合一、次氯酸钠、优氯净等)[6-7]；中等水平消毒剂如碘伏、碘酒、乙醇、煤酚皂、高锰酸钾；及低水平消毒剂，该类消毒剂性质稳定、能长期贮存，无异味，无刺激性，但杀菌谱窄，仅对芽胞有抑制作用，如季胺盐类等[8-9].

本研究一方面研究加入消毒型洗衣液是否真的有抑菌效果；另一方面在中温淀粉酶和中温纤维素酶中添加1%的消毒型洗衣液，从而研究添加消毒型洗衣液是否能影响淀粉酶和纤维素酶的活力，了解对加酶洗衣液洗涤的影响.

1 实验材料与方法

1.1实验材料LB培养基(固体和液体)，大肠杆菌，藤黄八叠球菌，20 mg/mL的四环素，20 mg/mL的氨苄青霉; pH 6.5的0.2 mol/L磷酸缓冲液，1%的可溶性淀粉溶液，1%的羧甲基纤维素钠溶液，3,5-二硝基水杨酸显色液(DNS)，中温淀粉酶，中温纤维素酶，妙凌牌消毒型洗衣液.

1.2仪器和设备牛津杯、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、 恒温水浴锅、磁力搅拌器、酶标仪等.

1.3方法

1.3.1 牛津杯法测定消毒型洗衣液抑菌效果 测定消毒型洗衣液的抑菌活力可用牛津杯法(也叫管碟法). 在涂布检验菌的平板上放上牛津杯，然后在牛津杯中加入抗生素. 抗生素在扩散过程中会形成浓度由高到低的范围，菌体在平板上生长，在高浓度范围长不出来，会在最低抑菌浓度范围长出来，从而形成透明的抑菌圈. 抗生素浓度和活力越高，抑菌圈越大[10-12]. 其中，阴性对照为无菌水，藤黄八叠球菌的阳性对照为四环素(Tet)，大肠杆菌的阳性对照为氨苄青霉素(Amp).

1.3.2 DNS法测定消毒型洗衣液对其中淀粉酶、纤维素酶酶活的影响 淀粉酶、纤维素酶酶的活力用3, 5-二硝基水杨酸的显色反应来测定. 淀粉或者羧甲基纤维素钠生成的还原糖与3, 5-二硝基水杨酸生成棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比. 以每克样品在一定时间内生成的还原糖(葡萄糖)量表示酶活大小.

标准曲线的绘制：分别取葡萄糖标准液(1 mg/mL)0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，于15 mL试管中，添加蒸馏水至1.0 mL, 分别准确加入DNS试剂2 mL，沸水浴加热2 min，流水冷却，用水补足到15 mL刻度. 在540 nm波长下测定吸光度，结果见表1. 以吸光度为横坐标，葡萄糖含量为纵坐标绘制标准曲线，如图1所示.

表1 不同浓度葡萄糖标准液DNS法测定A540值

图1 葡萄糖A540的标准曲

酶活测定反应体系： 在450 μL淀粉或者羧甲基纤维素钠底物中加入1%的洗衣液5 μL，35 ℃预热5 min后，然后加入相应的中温纤维素酶或中温淀粉酶样品45 μL，混合35 ℃反应10 min，然后沸水浴5 min，冷却后加入DNS试剂500 μL, 混合沸水浴5 min，冷却后将反应液样品加到酶标板上，用酶标仪测定540 nm下吸光值；同时，按上述体系，做不加l%的洗衣液的样品空白对照和l%的洗衣液、酶样品都不加的标准空白对照, 每组实验做3次重复. 酶活力单位的定义为：在上述条件下，1 mg酶每分钟催化羧甲基纤维素钠或淀粉水解生成葡萄糖毫克数定为一个活力单位. 酶活力/(U/mg)= 酶液稀释倍数 ×A540对应的葡萄糖量 / (10×0.045)，其中10——反应所用时间/min, 0.045——反应酶液体积/mL.

2 结果与分析

2.1消毒型洗衣液对藤黄八叠球菌、大肠杆菌的抑菌效果消毒型洗衣液对细菌抑菌能力的结果见图2. 在含藤黄八叠球菌(革兰氏阳性菌)检测菌的平板上，消毒型洗衣液稀释10倍和稀释20倍的都有明显的抑菌圈，但是稀释20倍的抑菌圈直径较小；而在含大肠杆菌(革兰氏阴性菌)的平板中加入稀释10倍、20倍的洗液液基本上没有抑菌圈，说明该消毒型洗衣液对大肠杆菌无抑菌效果，对藤黄八叠球菌有抑菌效果，这也说明该消毒型洗液只能选择性抑制革兰氏阳性菌，而对革兰氏阴性菌并没有效果.

图2 消毒型洗衣液对藤黄八叠球菌、大肠杆菌的抑菌效果阴性对照加的都是无菌水，左边阳性对照加的是四环素(Tet)、右边阳性对照加的是氨苄青霉素(Amp)

2.2DNS法测定消毒型洗衣液对淀粉酶酶活的影响使用酶标仪540 nm波长处测定标准空白(A0)、样品空白和加了1%洗衣液样品溶液(A)的吸光值，A540为实测吸光值，根据直线回归方程计算中温淀粉酶的酶活，结果见表2.

表2 测得的中温淀粉酶样品吸光度及算得的酶活

图3 洗衣液对淀粉酶活力的影响

在未加入1%洗衣液条件下，测得的中温淀粉酶的酶活力为18 789 U/mg；加入1%洗衣液后，测得的中温淀粉酶的酶活力为12 620 U/mg，如图3所示. 加入1%洗衣液后，淀粉酶的活力降低了32.8%，说明洗衣液中的消毒液等成分，对洗涤用酶淀粉酶有很大的影响.

2.3DNS法测定消毒型洗衣液对纤维素酶酶活的影响使用酶标仪540 nm波长处测定标准空白(A0)、样品空白和加了1%洗衣液的样品溶液(A)的吸光值，A540为实测吸光值，根据直线回归方程计算中温淀粉酶的酶活，结果见表3.

表3 测得的中温纤维素酶样品吸光度及酶活

图4 洗衣液对纤维素酶活力的影响

从图4可看出，在未加入1%洗衣液条件下，测得的中温纤维素酶的酶活力为535 U/mg；加入1%洗衣液后，测得的中温纤维素酶的酶活力下降为506 U/mg，降低5.4%. 因此，加入1%洗衣液后，虽然纤维素酶的酶活有一定程度降低，但影响不是很大.

3 讨论与展望

多年的应用实践证明，与传统洗涤剂相比，加酶洗涤剂的优点主要在于：①加酶洗涤剂具有良好的性价比，洗涤剂生产企业可以在不增加成本的基础上真正改善产品的洗涤性能，提高产品质量；②通过适量添加生物酶制剂的方式，可以调整优化洗涤剂的产品配方，从而减少甚至不用三聚磷酸钠，减轻洗涤剂对于水体的富营养化效应，降低洗涤剂使用给环境带来的污染. 据中国洗涤用品工业协会统计，进入新世纪，我国加酶洗涤剂产品迅速增加，目前已占洗涤产品的60%. 在不久的将来，各种加酶洗涤剂新产品将有望进一步取代传统的合成洗涤剂，成为我国洗涤剂市场的主流产品.

为了突出洗衣液的额外功能，一些商家在洗衣液中额外添加消毒剂等成分. 从本研究的结果来看，仅加入1%的消毒型洗衣液就对淀粉酶和纤维素酶的活力产生大的影响. 但衣物污垢中油脂性污垢和蛋白类污垢普遍存在的, 为提高洗衣粉去污效果, 在洗衣粉中可加入脂肪酶和蛋白酶. 因此，需要进一步研究消毒型洗衣液对蛋白酶、脂肪酶等酶的酶活力的影响，做出综合的评判.

另外，本研究中选用的淀粉酶和纤维素酶属于温和中温酶，可能不能适应消毒型洗衣液这样复杂的环境. 因此，为了满足消毒型洗衣液的使用环境，需要筛选或改造淀粉酶、纤维素酶以满足消毒型洗衣液的pH、离子强度等环境.

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Theeffectsofdisinfectantlaundrydetergentonenzymeactivitiesofamylaseandcellulase

WANG Shengchen, ZHOU Yuling, ZHANG Guimin

(College of Life Sciences，Hubei University，Wuhan 430062，China)

For the common starchy dirt (chocolate, mashed potatoes, noodles and porridge) on clothing, laundry detergent which contains amylase can remove dirt effectively. While micro-hair and small pompon appear on the main fibers due to repeated washing of the fabric surface, the cellulase in laundry detergent can remove micro-hair and small pompon on the primary fibers, then, the main fibers become smooth and soft, while it has whitening effect. In this study, two representatives of Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria (SarcinaluteaandEscherichiacoli) were selected, antibacterial effect for the two-type bacteria of disinfection type of laundry detergent was determined by using Oxford cup method, the results showed that the disinfectant type of laundry detergent had antibacterial effects onSarcinalutea(Gram-positive bacteria), however no inhibitory effect onEscherichiacoli(Gram-negative bacteria). Besides, the mesophilic amylase and cellulase samples were applied for the research, the impact of enzyme activities of two enzymes generated by adding laundry detergent was determined by DNS colorimetry assay. It turned out that enzyme activities of the mesophilic amylase and cellulase reduced 32.8% and 5.4% after adding one percent of laundry detergent, respectively. The conclusions of the study showed that compositions of disinfectant laundry detergent had certain effects on the enzyme activities of amylase and cellulase in detergent industry.

amylase; cellulase; laundry detergent; antibacterial effect; 3,5-dinitrosalicylic acid; enzyme activity

2017-02-28

国家自然科学基金(31670069)资助

汪声晨(1992-)，男，硕士生；周玉玲，通信作者，副教授， E-mail：zyl609@hubu.edu.cn

1000-2375(2017)06-0616-04

Q556

A

10.3969/j.issn.1000-2375.2017.06.010

(责任编辑 游俊)