张顺平，袁建平，吕 艳

(1.曲靖市食品药品检验检测中心中药室，云南 曲靖 655000； 2.曲靖市第一人民医院药剂科，云南 曲靖 655000)

高效液相色谱法同时测定头痛宁口服液中芍药苷和阿魏酸的含量

张顺平1*，袁建平2，吕 艳2

(1.曲靖市食品药品检验检测中心中药室，云南 曲靖 655000； 2.曲靖市第一人民医院药剂科，云南 曲靖 655000)

目的：建立同时测定头痛宁口服液中芍药苷和阿魏酸含量的高效液相色谱法。方法：色谱柱为Amethyst C18-H柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1%磷酸(V∶V=14 ∶86)，流速1.0 ml/min，柱温30 ℃，芍药苷的检测波长为230 nm，阿魏酸为316 nm。结果：芍药苷进样量在0.312 3～3.123 0 μg范围内线性关系良好(r=0.999 9)，平均加样回收率为99.88%(n=9，RSD=0.09%)；阿魏酸进样量在0.015 7～0.157 0 μg范围内线性关系良好(r=1.000 0)，平均加样回收率为99.75%(n=9，RSD=0.16%)。结论：本方法简便、快捷，精密度、重复性好，可用于头痛宁口服液的质量控制。

头痛宁口服液； 芍药苷； 阿魏酸； 高效液相色谱法； 含量测定

头痛宁口服液是曲靖市第一人民医院的医院制剂[批准文号：滇药制字(Z)20080174D号]，由川芎、当归、白芍、白芷等13味药制成，具有温经通络、散血化瘀、解痉止痛的功效，用于偏头痛、神经性头痛、风寒感冒头疼等的治疗。头痛宁口服液处方中的白芍含有芍药苷[1]，当归、川芎均含有阿魏酸[2-3]，但目前未见同时测定上述2种成分的报道。本研究建立了双波长高效液相色谱法同时测定头痛宁口服液中的芍药苷和阿魏酸的含量，现报告如下。

1 材料

1.1仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪(含有四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器，美国安捷伦科技有限公司)；KQ-300UDB型双频数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；METTLE MS205DU电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；一体式超纯水仪(PURELAB Flex 3，英国ELGA公司)。

1.2药品与试剂

芍药苷对照品(批号：110736—201539，含量96.4%)、阿魏酸对照品(批号：110773—201012，含量99.6%)均购于中国食品药品检定研究院；头痛宁口服液(云南省曲靖市第一人民医院，规格：1瓶100 ml，批号：20160512、20160810、20161029)；乙腈为色谱纯，甲醇、磷酸为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为Amethyst C18-H柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.1%磷酸(V∶V=14 ∶86)；流速1.0 ml/min；柱温30 ℃；进样量5 μl；采用双波长检测，芍药苷的检测波长为230 nm，阿魏酸为316 nm。

2.2溶液的制备

2.2.1 对照品储备溶液：精密称取芍药苷对照品32.40 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，制得3.123 4 mg/ml芍药苷对照品储备溶液；精密称取阿魏酸对照品15.76 mg，置于100 ml容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，制得0.1 570 mg/ml阿魏酸对照品储备溶液。

2.2.2 混合对照品溶液：精密量取“2.2.1”项下芍药苷对照品储备溶液、阿魏酸对照品储备溶液各1.0 ml，置于同一10 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得(每1 ml溶液中含芍药苷0.312 3 mg、阿魏酸0.015 7 mg)。

2.2.3 供试品溶液：精密量取样品3.0 ml，置于25 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.4 阴性对照溶液：按处方及工艺制备缺白芍、当归和川芎药材的阴性样品(由云南省曲靖第一人民医院提供)，再按“2.2.3”项下方法制备，即得。

2.3方法学考察

2.3.1 专属性试验：分别精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各5 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，x记录色谱图。结果显示，供试品溶液在与混合对照品溶液相应位置上有相同保留时间的色谱峰，的23.33%(14/60) 而阴性对照溶液在对应位置无吸收；供试品溶液的主峰与其相邻色谱峰均能达到基线分离，杂质对样品中芍药苷和阿魏酸的测定无干扰，见图1。

A. 混合对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照溶液；1.芍药苷；2.阿魏酸；(1)230 nm；(2)316 nmA. mixed control solution; B.test solution; C.negative control solution; 1.paeoniflorin; 2.ferulic acid；(1)230 nm；(2)316 nm图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.3.2 线性关系考察：分别精密吸取“2.2.1”项下芍药苷对照品储备溶液与阿魏酸对照品储备溶液各0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1.0 ml，依次置于10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件进样测定3次，记录峰面积。以进样量(X，μg)为横坐标，峰面积平均值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。芍药苷回归方程为Y=1 304.698 0X-8.213 3(r=0.999 9)，阿魏酸回归方程为Y=2 307.388 2X-0.392 3(r=1.000 0)。结果显示，芍药苷进样量在0.312 3～3.123 0 μg、阿魏酸进样量在0.015 7～0.157 0 μg范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验：精密吸取“2.2.2”项下的混合对照品溶液5 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定6次，记录峰面积。结果显示，芍药苷、阿魏酸峰面积的RSD分别为0.36%、0.40%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验：取供试品溶液(批号：20161029)适量，分别于室温(25 ℃)下放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，芍药苷、阿魏酸峰面积的RSD分别为0.46%、0.52%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.5 重复性试验：精密量取样品(批号：20161029)6份，每份3.0 ml。按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样5 μl测定，记录峰面积。结果显示，每1 ml样品中含芍药苷2.167 8 mg，RSD为0.26%；含阿魏酸0.185 1 mg，RSD为0.36%。

2.3.6 加样回收率试验：精密量取样品(批号：20161029)9份，每份1.0 ml，分别精密加入低、中、高3种不同浓度的混合对照品溶液，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=9)Tab 1 Results of recovery test(n=9)

2.3.7 样品含量测定：取3批样品，每批3份、每份3.00 ml，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以外标法计算样品中芍药苷、阿魏酸的含量，结果见表2。

表3 含量测定结果(n=3)Tab 3 Results of content determination(n=3)

3 讨论

白芍、当归、川芎为方中主药。白芍主要有效成分为芍药苷，具有扩张血管、镇痛镇静、解热解痉的功效；当归、川芎主要有效成分为阿魏酸，具有镇静、抗血小板聚集、抗炎、抗氧化的功效。故本研究选取方中有效成分芍药苷、阿魏酸进行含量测定[4]。单独对芍药苷[5]或阿魏酸[6-7]的定量分析已有相关报道，但同时测定2个成分更能有效控制其质量。

本研究考察了3种流动相，分别为(1)乙腈-0.1%磷酸(V∶V=14 ∶86)[8]；(2)甲醇-0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液(V∶V=28 ∶72)[9]；(3)乙腈-水(V∶V=14 ∶86)[10]。结果显示，流动相(1)保留时间合适且各成分获得较好的分离，流动相(2)出峰较晚且基线有漂移，流动相(3)检测不到阿魏酸，故最终采用流动相(1)。

参考《中华人民共和国药典》(2015年版)及相关文献中芍药苷、阿魏酸的含量测定方法，分别在230、240[11]、250[12]、316、320[13]、321、322[14]、323 nm[15]下进行考察。结果显示，芍药苷在230、240、250 nm波长下均有吸收，但在230 nm处吸收度最大；阿魏酸在316、320、321、322、323 nm波长下均有吸收，但在316 nm处吸收度最大，基线分离较好，且主成分峰无其他杂质干扰。因此，芍药苷的检测波长选择230 nm、阿魏酸选择316 nm。本研究采用双波长法测定芍药苷和阿魏酸，但对仪器的要求较高，因此使用了不同仪器进行考察。如果仪器无法进行双波长同时测定，也可以采用波长切换技术、梯度洗脱，亦能实现2个成分的同时测定。

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ContentDeterminationofPaeoniflorinandFerulicAcidinToutongningOralLiquidbyHPLC

ZHANG Shunping1, YUAN Jianping2, LYU Yan2

(1.Dept.of Chinese Medicine, Qujing Inspection Center for Food and Drug, Yunnan Qujing 655000, China; 2.Dept.of Pharmacy, the First People’s Hospital of Qujing, Yunnan Qujing 655000，China)

OBJECTIVE: To establish the method for content determination of paeoniflorin and ferulic acid in Toutongning oral liquid by HPLC. METHODS: The column was Amethyst C18-H(200 mm×4.6 mm, 5 μm), the mobile phase consisted of acetonitrile- 0.1% phosphoric acid(V∶V=14 ∶86)at the flow rate of 1.0 ml/min. The column temperature was 30 ℃，the detection wavelength of paeoniflorin and ferulic were respectively 230 nm and 316 nm. RESULTS: Good linearity was shown in the range of 0.312 3-3.123 0 μg(r=0.999 9) for paeoniflorin with the average recovery of 99.88%(n=9，RSD=0.09%) and 0.0157 0-0.157 0 μg (r=1.000 0) for ferulic acid with the average recovery of 99.75%(n=9，RSD=0.16%). CONCLUSIONS: This method is simple, rapid with good precision and repeatability, which can be used for the quality control of Toutongning oral liquid.

Toutongning oral liquid; Paeoniflorin; Ferulic acid; HPLC; Content determination

R927.2

A

1672-2124(2017)09-1232-03

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.09.030

*主管药师。研究方向：食品药品质量控制。E-mail：xiaoben84@126.com

2017-03-07)