●杨绪峰

BMP-2在骨折三期愈合表达影响实验研究

●杨绪峰

目的：观察BMP-2在骨折愈合三期治疗过程中表达，探讨其对骨折愈合的影响。方法：家兔建立骨折模型(n=105)，将105只家兔随机分为三期治疗组、一期治疗组和对照组，每组35只。每个小组再随机分7个小组( n = 5/组)，分别为第3、6、9、14、28、42、56天组。并进行取材，组织学及免疫组化法检测分析。结果：各组术后骨折端BMP-2表达阳性细胞平均光密度(MOD)值:三期组＞一期组＞模型组(P＜0.05)。结论：BMP-2能显著促进骨折愈合。

骨折；骨形态发生蛋白；免疫组化；家兔

骨折为临床的常见病，多发病。随着现代运输业及交通业的迅速发展，人们的出行及工作环境的变化，骨折病人呈现越来越多趋势，其损伤程度也越来越来越复杂，并出现创伤年轻化，高致残率的特点。患者骨折以后，多伴有肢体功能障碍，因各种原因发生的骨折延迟愈合和不愈合严重危害人们的生存质量，对患者及整个家庭带来了严重的精神压力和经济压力。由于骨折愈合的分子机制不是完全明了，因此，如何促进骨折愈合一直是学者们研究的热点。骨折愈合的组织修复过程十分复杂，期间涉及许多蛋白信号因子，来调节细胞的增殖、分化及细胞外基质合成，其中对骨原细胞的分化起主要决定性作用的骨形态发生蛋白(BMP-2)，是促进成骨的重要因子[1]，是唯一可独自诱导成骨的重要信号蛋白因子，是研究骨折愈合机制的重点。本实验建立兔骨折模型，将BMP-2作用于兔桡骨骨折断端，探讨BMP-2在骨折三期愈合中的影响及机理，为临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 骨折模型建立

选取健康的雄性新西兰大白兔105只（济南西岭角种兔养殖繁育中心提供，许可证号SCXK鲁20100005），体重（2.5±0.5）kg。氯胺酮8 mg/ kg腹腔内注射麻醉，常规脱毛，参照 Farso Nielsen方法[2]选取右前肢中下段外侧切口，无菌条件下纵行切开约1 cm，暴露桡骨，用牙科磨钻（直径0.5 mm）横行断开桡骨，止血、冲洗、缝合切口。实验组兔在切口缝合前于骨折处注射BMP-2（北京中科物源生物科技有限公司），注射剂量1ug/kg；对照组兔于骨折处注射生理盐水。术后两组实验动物均不作任何固定，术后肌肉注射青霉素80万单位/次/，每天一次，连续三天。

1.2 分组

将选取的105只家兔随机分三期治疗组、一期治疗组和对照组，每组35只。每个小组再随机分7个小组( n=5/组)，分别为第 3、6、9、14、28、42、56 天组。

1.3 试剂

重组人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)，浓度1mg/m l（北京中科物源生物科技有限公司提供）。鼠抗兔BMP-2抗体（福州迈新生物技术开发有限公司）。4%多聚甲醛溶液（行知生物科技有限公司），EDTA溶液(自配，PH 7.3-7.5)， DAB显色剂（上海亨代劳商贸有限公司），5%的正常山羊血清（上海睿鹰生物科技有限公司）。HOLOGIC双能X线吸收仪（HOLOGIC公司，美国），Olympus BX43F型光学显微镜，Olympus DP70高分辨率相机。

1.4 分期

将家兔桡骨骨折愈合过程分为早期、中期、后期:早期即血肿机化演进期，骨折后 1-7d；中期即骨痂原始形成期，骨折后 8-28天；后期即骨痂改造通常塑形期，骨折28天以后。三期治疗组配合早期加入活血化瘀药物，中期加入接骨药物，后期加入强筋壮骨药物。一期治疗组 把骨折三期合并为一期，BMP-2配合活血化瘀、强筋壮骨综合治疗。

1.5 观察方法

术后分别于第3、6、9、14、28、42、56天观察，每个实验组随机抽取1小组家兔。选取左侧桡骨标本作为观察对象，以骨折端为中心，切取桡骨段1.5cm，剔除软组织，用4%的多聚甲醛在4℃下固定30m in。后放入200g/L的EDTA液中脱钙，温度50℃，每天1h，脱钙结束后更换脱钙液，于室温下继续脱钙，2d后将骨组织完全脱钙，脱钙完成后将骨段纵行剖开，进行冰冻切片，厚度5μ m，行免疫组化染色，观察在不同骨折愈合时间点外骨膜、内骨膜和骨髓组织BMP-2的表达情况。

1.6 结果判断

显微镜下肉眼观察BMP-2在两组切片中表达情况，并进行比较。细胞核或胞浆内出现棕黄色颗粒染色的，细胞核清晰，形状规则，周围轮廓界限分明为阳性细胞，未显棕色为阴性。在两断端附近相同位置及骨折中心，应用显微图像采集系统，选取5个高倍视野(×400)，高分辨率相机拍照后，对免疫组化切片骨折断端附近的外骨膜、内骨膜和骨髓组织，储存入计算机，使用 Image- Pro- Plus IPP6.0医学病理图像分析系统软件，对 BMP-2在骨表达阳性细胞进行光密度(MOD)测定。1.7统计学分析采用

SPSS13.0统计学软件进行数据统计分析，计量资料以()表示，相同时间实验组与对照组比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

不同时间点骨折愈合BMP-2表达结果，在骨折愈合不同时间点，骨外膜、骨内膜、骨髓腔的BMP-2免疫组化染色结果显示，对照组及实验组骨折端均有显色，实验组较对照组术后大部分时间 BMP-2表达均高于对照组，差异有统计学意义( P＜0.05)。骨折愈合不同时间点，各组标本BMP-2表达测定结果见表1、2、3。

表1 骨折合愈过程不同时间点各组标本骨外膜BMP-2表达(MOD，±s，n =5)

表1 骨折合愈过程不同时间点各组标本骨外膜BMP-2表达(MOD，±s，n =5)

注：表示与对照组比较P＜0.05，表示与对照组比较P＜0.01；表示与一期治疗组比较P＜0.05，表示与一期治疗组比较P＜0.01。

时间 对照组 一期治疗组 三期治疗期3d 0.0576±0.0068 0.0948±0.0506** 0.0677±0.0033 6d 0.0647±0.0038 0.0728±0.0027* 0.0752±0.0055△9d 0.0591±0.0074 0.0746±0.0065** 0.0759±0.0040*14d 0.0645±0.0044 0.0798±0.0101** 0.0769±0.0067*28d 0.0630±0.0047 0.0715±0.0027* 0.7044±0.0150 42d 0.0645±0.0057 0.0788±0.0087** 0.0811±0.0128**△56d 0.0665±0.0053 0.0724±0.0040* 0.0725±0.0039*均值 0.0628±0.0060 0.0778±0.0200** 0.0791±0.0136**

表2 骨折合愈过程不同时间点各组标本骨内膜BMP-2表达(MOD，±s，n =5)

表2 骨折合愈过程不同时间点各组标本骨内膜BMP-2表达(MOD，±s，n =5)

注：表示与对照组比较P＜0.05，表示与对照组比较P＜0.01；表示与一期治疗组比较P＜0.05，表示与一期治疗组比较P＜0.01。

时间 对照组 一期治疗组 三期治疗期3d 0.1035±0.0171 0.1440±0.0190** 0.1528±0.0102**6d 0.1417±0.0042 0.1546±0.0163 0.1517±0.0118 9d 0.1585±0.0056 0.1485±0.0236 0.1669±0.0187△14d 0.1360±0.0172 0.1680±0.0149** 0.1838±0.0341*△28d 0.1512±0.0212 0.1564±0.0191 0.2008±0.0630**△△42d 0.1673±0.0055 0.1855±0.0145* 0.2110±0.0811**△△56d 0.1547±0.0168 0.1779±0.0122* 0.1704±0.0262*△均值 0.1447±0.0236 0.1621±0.0216* 0.1768±0.0452**△△

表3 骨折愈合过程不同时间点各组标本骨髓腔BMP-2表达(MOD，±s，n =5)

表3 骨折愈合过程不同时间点各组标本骨髓腔BMP-2表达(MOD，±s，n =5)

注：表示与对照组比较P＜0.05，表示与对照组比较P＜0.01；表示与一期治疗组比较P＜0.05，表示与一期治疗组比较P＜0.01。

时间 对照组 一期治疗组 三期治疗期3d 0.0258±0.0026 0.0261±0.0041 0.0365±0.0047*6d 0.0272±0.0045 0.0303±0.0047* 0.0348±0.0051*△9d 0.0262±0.0024 0.0396±0.0042* 0.0433±0.0060**△14d 0.0230±0.0035 0.0329±0.0052** 0.0372±0.0053*△28d 0.0293±0.0038 0.0350±0.0019* 0.0438±0.0051**△△42d 0.0307±0.0054 0.0389±0.0035 0.0485±0.0064**△△56d 0.0312±0.0065 0.0282±0.0030 0.0344±0.0037均值 0.0276±0.0049 0.0328±0.0063* 0.0398±0.0070*△

3 讨论

骨折的愈合是个复杂的动态过程，自 Urist[3]提出诱导成骨理论以后，学者们渐渐认识到 下列骨生长因子与骨折愈合关系较密切，如TGF-β1、BMP-2、bFGF、VEGF等。研究还发现，BMP-2对促进骨生成具有极其重要的作用，能够诱导不同种类未分化间充质干细胞增值和分化为成骨细胞，从而促进成骨和骨折的愈合。骨折愈合在早期的病理变化主要是[4-5]，骨折部位血肿的形成及浸润炎性细胞，骨折部位血肿大小会影响到软组织内新生血管的形成及机化完成所需的时间。在骨折早期给以BMP-2干涉，大大改善了骨折部位血液供给状况，加快了损伤的组织修复和局部水肿吸收，从而使骨折加速愈合。在兔骨折愈合过程中期[6]，BMP-2促进了软骨钙化，加快了软骨消散，促使软骨形成期得到提前，通过加快增殖和分化成骨细胞[7]，从而促进了骨痂生长以及外骨痂的桥接过程。到骨折后期，BMP-2提高了破骨细胞的活性与数量，促进髓腔的提前再通和板层骨的提早形成。新生的连续骨皮质形成以及再通的髓腔，可作为骨折愈合的组织学标准[8]。目前学者们研究BMP-2促进骨折愈合多阶段的动物实验较少，且往往都是试验组与空白对照组之间比较，这样只能说明BMP-2对骨折愈合有促进作用，但不能充分说明骨折三期 BMP-2对骨折愈合的影响。本实验表明在促进骨折局部BMP-2表达方面，无论是BMP-2表达总体平均水平、峰值持续时间，三期试验组明显强于对照组。

骨组织的愈合过程是骨折或者骨质缺损的修复，骨质的完全修复需要局部生长因子的调控。局部骨折的整个修复过程受骨生长因子的调控，其决定着骨折修复的质量和速度[9-10]。在骨诱导分化因子中，BMP-2被公认为是目前最强，其能诱导血管细胞或成软骨细胞，决定着间充质细胞的分化方向，诱导间充质细胞不可逆地向软骨细胞和成骨细胞方向分化，促进成骨细胞分化和刺激胶原合成，促使新骨生成。从实验结论来看，BMP-2表达出现在骨折愈合早期，外骨膜BMP-2表达第3天较低，第六天逐渐升高。骨折中期为骨痂形成初期，无论骨外膜、骨内膜、还是骨髓腔，BMP-2表达实验组均高于对照组，可能间充质细胞发生化学趋向、聚集，进而形成骨和软骨的过程。骨折后期，骨外膜、骨内膜及骨髓腔的BMP-2表达实验组均优于对照组。综上所述，在骨折三期愈合过程中，实验组（三期治疗组、一期治疗组）优于对照组，可能是BMP-2在各阶段促进了血管形成及骨的诱导分化，从而促进了骨折愈合。

（作者单位：新泰市人民医院）

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Experimental study of the BMP-2 expression on fracture healing by the three stage treatment

(Yang xu-feng，The people’s hospital of Xin Tai 271200)

Objective: To observe the three period treatment theory of bone fracture on the BMP-2 expression of rabbits in the issues of fracture healing，and to explore the effects of that method． Methods: Rabbits( n = 105) were make bone fracture models．Rabbits were random ly divided into three groups，including three-phase treatment group ( TTG ) ( n = 35 ) ，one-phase treatment group ( OTG) ( n = 35) ，and model control group( MCG) ( n = 35) ． Every group was random ly divided into seven groups.They have 3,6,9,14,28,42and56 day point( n = 5 ) ，The left radiuses were taken out as the research object． Immunohistochemistry stain was performed to examinate the BMP-2 expression in the fracture bone． Results: Group mean MOD ( mean optical density) in positive cell of the BMP-2 expression in every group at deferent time points and those of more time points after operation: TTG＞OTG＞MCG (P＜0.05) ． Conclusion: BMP-2 can promote fracture healing．

fracture；BMP-2；Immunohistochemistry；rabbits

杨绪峰（1973～），男，主治医师，硕士研究生，研究方向为骨外科临床。