贺 军，孔德超，张秋生，孔令斌 ,李 丽

1.济宁医学院附属医院消化内科，山东 济宁 272016； 2.济宁市第二人民医院内科； 3.济宁医学院

阿司匹林与二甲双胍对人结肠癌SW480细胞株的联合作用探讨

贺 军1，孔德超2，张秋生1，孔令斌1,李 丽3

1.济宁医学院附属医院消化内科，山东 济宁 272016； 2.济宁市第二人民医院内科； 3.济宁医学院

目的观察联合阿司匹林(Aspirin,ASA)与二甲双胍(Metformin,MET)对人结肠癌SW480细胞株的抑制作用，并探讨两者之间的相互作用方式。方法采用MTT法及流式细胞术检测空白对照组、ASA组、MET组及ASA与MET共同作用组对人结肠癌SW480细胞增殖及细胞凋亡的影响。结果单独使用ASA、MET对结肠癌SW480抑制率及其凋亡率均高于空白对照组，且72 h时抑制率及其凋亡率均高于24 h者；在干预24 h、72 h时，ASA与MET共同作用组的抑制率和凋亡率均明显高于单独使用MET组或ASA组，Q值分别为1.19和1.23。结论ASA和MET单独作用均对结肠癌SW480细胞有一定的抑制作用，且随着时间延长,抑制作用明显加强；联合使用MET和ASA对人结肠癌SW480细胞具有协同抑制作用。

阿司匹林；二甲双胍；SW480细胞株；联合作用

结直肠癌是消化道常见肿瘤之一，一旦发现多属晚期，缺乏有效的治疗手段，目前已成为全球癌症死亡的第四大病因和我国发病率居第三位的恶性肿瘤[1]，因此，开展有效的防治至关重要。阿司匹林(Aspirin, ASA)过去一直被应用于解热镇痛和抗风湿及心脑血管疾病的预防和治疗中，但于1988年Kune等[2]报道，ASA可降低结直肠癌发生率，因此，ASA与其他非甾体抗炎药在肿瘤防治方面的作用引起学者们的广泛关注。二甲双胍(Metformin, MET)是双胍类口服降糖药，因其兼具有效性、安全性和经济性，从20世纪50年代研制成功后一直在临床上得以广泛使用。但近期的回顾性调查[3-4]发现，使用MET的T2MD患者患肿瘤的风险明显低于使用其他降糖药的患者，由此，MET作为抗肿瘤药物的研究也成为研究热点。但临床上单独使用ASA或MET预防肿瘤时多用量较大，不良反应也较大，为了减少其不良反应，本研究探讨了联合小剂量ASA和MET的抗结肠癌作用，为临床防治结肠癌提供方法依据。

1 材料与方法

1.1材料人结肠癌细胞株SW480购自中科院上海细胞库，低温保存，实验前将结肠癌细胞株SW480用25 ml培养瓶培养，放于37 ℃、体积分数为5%的CO2的培养箱中培养，待细胞铺满培养瓶后置于超净台中，倒掉里面的培养基。用5 ml PBS冲洗2次，然后加入3 ml胰蛋白酶，消化5 min后，细胞成片脱落，用一次性无菌吸管吹打均匀后放入离心管中，再加入3 ml培养基(全培)，终止消化，然后放入水平离心机中800 r/min离心10 min，取出离心管，小心吸取上清液后丢弃，取胰蛋白酶对融合度达90%的细胞进行消化传代，待细胞铺满约85%瓶壁后，小心吸取废液丢弃，重复以上操作，最后取出离心管后可见底部成块的细胞团，弃掉上清液，加入3 ml全培后吹匀。将吹打均匀的悬液加入培养瓶或培养板中，再加入适量的全培使总量约5 ml，然后放入培养箱中培养。取处于对数生长期的人结肠癌细胞株SW480，随机分为4组，A组(空白对照组)：对照组常规培养基培养(包括相同量的DMSO及蒸馏水);B组(ASA组)：培养基中加入ASA 2 mmol/L;C组(MET组)：培养基中加入MET 5 mmol/L;D组(ASA与MET共同作用组)：培养基中分别加入与B、C组中相同浓度的ASA和MET。培养24 h和72 h后分别检测4组细胞的抑制率和细胞凋亡率。

1.2MTT检测4组细胞分别干预后继续放至培养箱中培养，在24 h、72 h分别取出相应96孔板，并在每孔中加入20 μl MTT，即MTT浓度为50 g/L，继续培养4 h，此时将MTT还原为甲臜(倒置显微镜下可看到孔内的细胞周围出现丝状紫色结晶体)，小心吸去上清，然后每孔加入200 μl二甲基亚砜，放置在摇床上低速震荡10 min后，待紫红色结晶完全溶解后放于酶联免疫检测仪上测其OD值。吸光度值：在酶联免疫检测仪测定样品在490 nm光吸收值，以未加药品仅加入溶剂的孔设置为对照孔，并按抑制率=1-(实验组-空孔)/(空白对照组-空孔)的公式[5],计算各种药物及浓度对细胞的抑制率。

1.3细胞凋亡率的检测分别取干预24 h和72 h的4组SW480细胞，按照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书步骤操作，流式细胞仪Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测。激发波长Ex=488 nm，发射波长FL1(Em=525±20 nm)；FL2(Em=585±21 nm)，每个样本采集细胞数为10 000个，用FlowJo软件分析细胞不同状态(主要是早凋、晚凋与死亡)的比例及数目。

1.4联合作用的判断标准联合作用的判断采用金正均公式计算Q值判断，Q值=Ea+b/[Ea+(1-Ea)×Eb]，其中Ea+b为两种药物联合后的抑制率，Ea及Eb分别为药物a和b的抑制率。如Q值>1.15表示药物具有协同作用，Q值<0.85表示药物具有拮抗作用，Q值为0.85～1.15表示药物具有相加作用。

2 结果

2.1ASA与MET联合作用对结肠癌SW480细胞的抑制作用及Q值在24 h及72 h，不同组别结肠癌SW480细胞的抑制率及其Q值如表1所示，提示该浓度下的ASA和MET具有协同作用，且除空白对照组外，72 h的抑制率明显大于24 h。ASA和MET共同作用24 hQ值为1.19，72 hQ值为1.23。

表1 不同时间ASA与MET单独及联合作用后的抑制率及Q值

注：与ASA+MET组比较，*P<0.05。

2.2ASA与MET联合作用对结肠癌SW480细胞凋亡的影响根据使用GraphPad Prism软件计算出的ASA及MET的IC50分别稍高于ASA 2 mmol/L及MET 5 mmol/L，基于在研究药物相互作用时多选择稍低于IC50的浓度，本研究选用ASA 2 mmol/L及MET 5 mmol/L研究其两者对细胞凋亡的联合作用。

如图1所示，右上象限代表晚期凋亡细胞，右下象限代表早期凋亡细胞，左上象限代表裸核细胞，左下象限代表正常细胞。细胞凋亡率为早期凋亡率与晚期凋亡率的总和。ASA 2 mmol/L及MET 5 mmol/L单独干预SW480细胞72 h后的凋亡率均明显高于空白对照组(P<0.05)，两药联合后的凋亡率明显高于单药组(P<0.05)。提示两药可以协同增加SW480细胞的凋亡。

图1 ASA与MET对结肠癌SW480细胞凋亡的影响Fig 1 Effects of ASA and MET on apoptosis of colon cancer SW480 cell lines

3 讨论

结肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，有较高的发病率及死亡率。近年来，随着饮食结构的改变，在我国的发病率与死亡率呈缓慢上升趋势[1]，其中，相当一部分患者在确诊时已伴有其他脏器的转移[6]，一旦出现远处转移，其中位生存期往往少于2年，总体5年生存期低于10%。而晚期结肠癌的传统化疗药物如氟尿嘧啶等细胞毒性药物，均具有较大的不良反应，给患者带来较大的痛苦。而且结肠癌的发生、发展是一个涉及到多因素、多基因、多个阶段渐进性积累的复杂过程。近年来临床流行病学发现，ASA、MET等药物可以预防或治疗结肠癌及预防结肠腺瘤的发生；ASA不仅可以减少结肠癌、肺癌、食管癌、胃癌和卵巢癌的风险，还可以作为结肠癌和肺癌的化疗药物使用[7]。流行病学显示，长期口服非甾体类药物与对照组相比，死于结肠癌的风险要降低40%～50%[8]，基于多项临床证据，2016年美国预防服务工作组(USPSTF)推荐50～59岁的部分心血管高风险患者可以将ASA作为心血管疾病及结直肠癌的一级预防用药(B级推荐)。另外，也有报道[9]指出，MET可以预防或治疗结肠癌及预防结肠腺瘤的发生。考虑到ASA、MET单独抗肿瘤使用剂量较大，因此带来较多的不良反应，影响了它的使用范围，故本研究开展了ASA和MET抗肿瘤的联合作用，以期探讨小剂量ASA联合MET在结肠癌预防中的防治效果。

本研究发现，在2 mmol/L ASA和5 mmol/L MET共同作用时，两者对结肠癌SW480细胞具有协同抑制作用，并且72 h的抑制率明显大于24 h。进一步研究发现，ASA 2 mmol/L及MET 5 mmol/L单独干预SW480细胞48 h后的凋亡率均明显高于空白对照组，两药联合后的凋亡率明显高于单药组，目前有关联合使用ASA和MET预防结直肠癌的报道尚未发现。结果提示，联合使用适当浓度的ASA和MET有可能较单独使用ASA预防结直肠的效果更好，且不良反应小。

其抑制的机制目前还不明确，在结肠癌的发展过程中，MMP-9蛋白具有重要的作用。MMPs是一类与锌结合的具有降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的内肽酶家族，在肿瘤浸润和转移中起关键作用。MMP-9是其中重要的一员，其分泌明胶酶B，能够降解基底膜的大部分成分，如明胶、胶原蛋白、纤连蛋白、弹力蛋白等，从而降解、破坏靠近肿瘤表面ECM和基底膜(BM)，使肿瘤沿缺失的BM向周围组织浸润，促进肿瘤的侵袭和转移，同时在肿瘤间质血管生成中起重要作用。而MMP-9可以受NF-κB通路的调控。MET主要通过AMPK、NF-κB等通路发挥抗肿瘤作用[10]。MET作为AMPK激活剂，可以通过AMPK-mTOR通路、降低胰岛素水平、抑制肿瘤干细胞增殖及NF-κB通路等机制发挥抗肿瘤作用[11]。Moiseeva 等[12]在人胚肺成纤维细胞的模型上研究MET抑制衰老的机制时发现，TCF4、NF-κB1(P50)、RelA是MET基因水平调控最明显的几个转录因子，并且在进一步的研究中证实，无论AMPK通路是否激活，MET都可以抑制NF-κB的活化。ASA能够通过直接抑制IκΒα的磷酸化来抑制NF-κB活化[13]。提示无论ASA还是MET抑制肿瘤的机制可能均通过抑制NF-κB活化起作用。

虽然，联合ASA和MET的抗肿瘤机制尚未完全明确，但综合以上研究认为，两种药物可能通过对NF-κB活化，进而影响与肿瘤的侵袭、转移等密切相关的MMP-9蛋白而发挥抗肿瘤作用。应进一步研究其可能的机制，为联合ASA和MET抑制结直肠癌的发生提供理论支持，最终应用于临床实践。

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012 [J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65(2): 87-108.

[2] Kune GA, Kune S, Watson LF. Colorectal cancer risk, chronic illnesses, operations, and medications: case control results from the Melbourne Colorectal Cancer Study [J]. Cancer Res, 1988, 48(15): 4399-4404.

[3] Kordes S, Pollak MN, Zwinderman AH, et al. Metformin in patients with advanced pancreatic cancer: a double-blind, randomised, placebo-controlled phase 2 trial [J]. Lancet Oncol, 2015, 16(7): 839-847.

[4] Kowall B, Stang A, Rathmann W, et al. No reduced risk of overall, colorectal, lung, breast, and prostate cancer with metformin therapy in diabetic patients: database analyses from Germany and the UK [J]. Pharmacoepidemiol Drug Saf, 2015, 24(8): 865-874.

[5] 郭相丽, 钱鹏, 朱炳喜, 等. 二氢辣椒素对人CD3AK细胞杀伤结肠癌SW-480和SW-620细胞的影响[J]. 胃肠病学和肝病学杂志, 2017, 26(2): 134-137.

Guo XL, Qian P, Zhu BX, et al. Effect of Dihydrocapsaicin on the cytotoxic activity of CD3AK cells against colon cancer cell lines SW-480 and SW-620 [J].Chin J Gastroenterol Hepatol,2017,26(2):134-137.

[6] Favoriti P, Carbone G, Greco M, et al. Worldwide burden of colorectal cancer: a review [J]. Updates Surg, 2016, 68(1): 7-11.

[7] Bibbins-Domingo K, U.S. Preventive Services Task Force. Aspirin use for the primary prevention of cardiovascular disease and colorectal cancer: U.S. preventive services task force recommendation statement [J]. Ann Intern Med, 2016, 164(12): 836-845.

[8] Flossmann E, Rothwell PM, British Doctors Aspirin Trial and the UK-TIA Aspirin Trial. Effect of aspirin on long-term risk of colorectal cancer: consistent evidence from randomised and observational studies [J]. Lancet, 2007, 369(9573): 1603-1613.

[9] Sehdev A, Shih YC, Vekhter B, et al. Metformin for primary colorectal cancer prevention in patients with diabetes: a case-control study in a US population [J]. Cancer, 2015, 121(7): 1071-1078.

[10] Guttman D, Stern Y, Shpitzer T, et al. Expression of MMP-9, TIMP-1, CD-34 and factor-8 as prognostic markers for squamous cell carcinoma of the tongue [J]. Oral Oncol, 2004, 40(8): 798-803.

[11] Tan XL, Bhattacharyya KK, Dutta SK, et al. Metformin suppresses pancreatic tumor growth with inhibition of NFκB/STAT3 inflammatory signaling [J]. Pancreas, 2015, 44(4): 636-647.

[12] Moiseeva O, Deschênes-Simard X, St-Germain E, et al. Metformin inhibits the senescence-associated secretory phenotype by interfering with IKK/NF-κB activation [J]. Aging Cell, 2013, 12(3): 489-498.

[13] Han G, Gong H, Wang Y, et al. AMPK/mTOR-mediated inhibition of survivin partly contributes to metformin-induced apoptosis in human gastric cancer cell [J]. Cancer Biol Ther, 2015, 16(1): 77-87.

SynergisticeffectsofcombinationofAspirinandMetforminoncoloncancerSW480celllines

HE Jun1, KONG Dechao2, ZHANG Qiusheng1, KONG Lingbin1, LI Li3

1.Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining 272016; 2.Department of Internal Medicine, the Second People’s Hospital of Jining; 3.Jining Medical University, China

ObjectiveTo observe the inhibitory effects of combination of Aspirin (ASA) and Metformin (MET) on the colon cancer SW480 cell lines, and to discuss the interaction between them.MethodsProliferation and apoptosis of colon cancer SW480 cell lines in blank control group, ASA group, MET group and combination of ASA and MET group were detected by MTT method and flow cytometry.ResultsThe inhibition rate and apoptosis rate of colon cancer SW480 cell lines in ASA group or MET group were higher than those in the blank control group, and the inhibition rate and apoptosis rate at 72 hours were higher than those at 24 hours independently. The inhibition rate and apoptosis rate in combination of ASA and MET group were significantly higher than those in MET group or ASA group at 24 hours and 72 hours, respectively. TheQvalues were 1.19 and 1.23, respectively.ConclusionASA and MET have a certain inhibition effect on colon cancer SW480 cell lines, and the inhibition effect is significantly increased over time, and the combination of MET and ASA has a synergistic effect on SW480 cell lines.

Aspirin; Metformin; SW480 cell line; Synergistic effect

R735.3+5

A

1006-5709(2017)10-1162-03

2017-06-10

济宁医学院大学生创新科研课题(JNYXYXSCX201510)

贺军，副主任医师，研究方向：消化道肿瘤防治。E-mail：hejun911@163.com

孔令斌，博士，主任医师，教授，研究方向：结直肠癌的防治。E-mail：klb3904@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.10.024