印 璞,乔 璐，杨照微，何成彦，孙景春，郑 岚

(1.吉林省临床检验中心，吉林 长春130021;2.吉林大学中日联谊医院；3.吉林大学口腔医院)

HSPD1在肾癌中的表达及意义

印 璞1*,乔 璐2，杨照微2，何成彦2，孙景春2，郑 岚3*

(1.吉林省临床检验中心，吉林 长春130021;2.吉林大学中日联谊医院；3.吉林大学口腔医院)

目的探讨HSPD1蛋白在肾癌及癌旁正常肾皮质组织的表达及其意义。方法应用二维色谱-质谱联用技术分析18例肾癌患者肿瘤标本，筛选出肾癌组织及癌旁正常肾皮质组织差异表达的HSPD1蛋白，并用免疫印迹验证其准确性。结果质谱鉴定后显示，HSPD1蛋白在肾癌组织中的表达水平低于癌旁正常肾皮质组织，免疫印迹证实其准确性。结论低表达的HSPD1可能与肾癌的发生发展有关。

热休克蛋白D1；肾癌；二维色谱-质谱联用技术

(ChinJLabDiagn,2017,21:1690)

肾癌，又称肾细胞癌(RCC)，是一种泌尿系统特有的恶性肿瘤，发病率仅次于膀胱癌，在泌尿系肿瘤中占据第二位。世界范围内，肾癌位居常见肿瘤第13位，2012年新发肾癌约338 000例，占所有肿瘤的2.4%， 死亡人数为144 000例，占所有肿瘤的1.7%[1]。由于其临床症状无特异性，因此早期诊断和治疗具有一定的难度。HSPD1蛋白是由核基因组编码的线粒体分子伴侣蛋白，对于线粒体内蛋白的转运、折叠具有重要作用，是线粒体的一个重要标志物。很多研究表明多种肿瘤中HSPD1的表达水平发生了异常改变，而且HSPD1的表达水平与肿瘤的临床特点、预后及进展等密切相关，因此本研究采用二维色谱-质谱联用技术以及免疫印迹技术，探讨HSPD1在肾癌及癌旁正常肾皮质组织中的差异表达及临床意义。

1 材料与方法

1.1组织标本的来源

本研究所用的组织标本均经病理学检查并证实为肾透明细胞癌，排除了多发肿瘤患者及术中发现已发生转移患者，手术前所有患者均没有经历过化疗、放疗或生物治疗。18例标本均来源于泌尿外科手术切除的18例新鲜组织标本，经过提前预冷的生理盐水冲洗去除血液、坏死组织，液氮速冻后，冻存于-80℃冰箱。

1.2主要的试剂及仪器

二硫代苏糖醇(DTT)、TPCK修饰的测序级胰蛋白酶购于美国Promega 公司。TMED、十二烷基苯磺酸钠(SDS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)购于美国Sigma 公司。碘代乙酰胺(IAM)、蛋白质的定量试剂盒(RCDC Protein Assay Kit)、尿素(Urea)购于Bio-Rad 公司。试验用水为经Milli-Q纯水仪制备的超纯水。LTQ XL型液质联用仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3实验方法

(1)组织样本总蛋白的提取及浓度测定：取出于-80℃保存的肾癌组织及癌旁组织，分别置于液氮中剪碎并研磨成粉末。加入裂解缓冲液(30 mmol/L Tris-HCL,9 mol/L Urea,65 mmol/L DTT,2 mmol/L PMSF),室温振荡1 h，使样本混合物充分的溶解。10 000 g， 4℃离心50 min后，仔细收集上清即为所需的总蛋白质。Bradford法(考马斯亮蓝染色法)测定蛋白质的浓度，在595 nm处测吸光度值，A595 nm为纵坐标，根据6个浓度标准蛋白的含量为横坐标绘制标准曲线，通过样本的吸光度值测定样本中蛋白质的含量，并分装保存于-80℃备用。

(2)组织样品蛋白分离及制备水解多肽混合物：从冰箱中取出-80℃保存的总蛋白样品，加入上样缓冲液后，煮沸5 min，进行电泳蛋白分离，切胶后用25 mmol/L NH4HCO3充分清洗。室温干燥后加入0.5 mM的DTT，在56℃条件下避光放置1小时。室温下加入0.5 mM的IAM，置于暗处反应40分钟。被分析蛋白和测序级胰酶分别按50∶1的比例加入反应体系中，放置在37℃水浴箱中孵育过夜。约20小时后酶切产物真空抽干，-80℃备用保存。

(3)二维色谱-质谱联用分离鉴定多肽混合物：将上述的样本用0.1%FA溶解后，每次取50 μg样本上样，通过串联的强阳离子交换柱和反相柱分离样品。强阳离子柱用9个不同浓度乙酸氨采用阶段洗脱的方法，将肽段洗脱至反相柱，再进行反相的分离；泵流速为200 μl/min，分流后的流速为2 μl/min。RPLC洗脱的多肽使用LTQXL离子肼质谱仪检测，应用数据依赖的采集模式进行次二级扫描。

(4)免疫印迹试验：对选定的目标蛋白HSPD1，采用免疫印迹试验对其在肾癌及癌旁组织的表达情况进一步验证。通过HSPD1蛋白条带与内参条带计算出相对灰度比值，从而间接反映各样本中HSPD1的表达水平。内参抗体β-Actin ，HSPD1单克隆抗体购于Thermo Fisher公司。

1.4统计学分析

通过主成分分析、t检验、聚类分析等统计方法分析二维色谱-质谱联用所得的数据，找到肾癌组织和癌旁组织之间的差异表达蛋白。

2 结果

2.1二维色谱与质谱联用分析肾癌组织与癌旁组织的蛋白酶解混合产物

应用二维液相色谱及质谱联用，对胶内酶解后的肾癌组织及癌旁组织的总蛋白进行分析，得到多个多肽序列及蛋白质鉴定数据。

2.2肾癌组织及癌旁组织差异蛋白质的质谱分析

差异蛋白鉴定时，以以下标准界定蛋白丰度的变化：两个样品中蛋白谱图数的差值≥72同时比值≥1，每种样品均行两次实验以避免假阳性的发生。本文主要将显著差异蛋白中下调表达的HSPD1作为目标蛋白进行研究，HSPD1的质谱结果见图1。

图1 HSPD1质谱图

2.3蛋白印迹分析

通过Western blot检测肾癌组织及癌旁组织中的HSPD1蛋白的表达情况。结果可见肾癌组织中HSPD1的表达水平显著低于配对的癌旁组织，见图2。

图2 HSPD1免疫印迹图

3 讨论

肾癌是泌尿系统中最常见的肿瘤之一，因其早期症状比较隐蔽，通常没有特异性的症状，到目前为止，还没有一种公认的肾细胞癌筛选、诊断、分层治疗和检测疗效的分子标志物出现，因此对肾癌的早期诊断仍是研究的热点[2,3]。蛋白质组学技术通常可以利用差异蛋白质的组学分析，从而发现疾病早期灵敏度高而且特异性强的肿瘤标志物，因此对于肿瘤的早期诊断、治疗以及预后的预测等方面具有非常重要的临床意义，已逐渐成为比较复杂生物样品中大量蛋白质的一种广受欢迎的方法[4-6]。

HSP是高度保守的蛋白质，作为分子伴侣参与广泛的生物过程。热激蛋白不仅在正常细胞条件下表达，大部分的热激蛋白在接触不同的环境胁迫时，其表达量也会显著增加[7]。热激蛋白的主要功能是负责维持细胞完整性，尤其当外界环境发生改变时，它们便会立即做出反应，根据分子量的不同，被分为小分子量热激蛋白，HSP40，HSP60(也称为HSPD1)，HSP70，HSP90和HSP100[8]。HSPD1参与热应激反应，热激反应是一个体内的平衡机制，它可以通过上调HSPD1的表达量从而保护细胞免受外界伤害[9]。除了参与热应激反应，HSPD1还参与多肽的折叠，研究表明HSPD1能帮助15%～30%的蛋白质进行折叠和构象[10]，此外HSPD1还参与蛋白质的运输和DNA代谢，HSPD1与线粒体转录因子结合，从而对线粒体DNA进行传播和复制[11]。近年来HSP家族在肿瘤发生发展中的作用愈受重视，本研究通过差异蛋白质组学筛选出的HSPD1，其分子量为60 kDa，也被报道与多种不同类型癌症发生相关[12,13]。HSPD1在胃癌组织中表达明显高于正常胃黏膜组织，而且还与某些临床病理参数有关，检测胃癌中的HSPD1的表达有助于预测胃癌细胞分化程度[14]。HSPD1在胰腺癌是高表达蛋白，细胞内表达增加与胰腺癌的发生、发展有关，并有可能是胰腺癌发展恶化的重要标志，是判断胰腺癌预后的重要指标[15]。一些前人的研究还表明，HSPD1在肺腺癌、宫颈癌及大肠癌等一些肿瘤疾病中表达水平显著升高，但在舌鳞状上皮细胞癌、膀胱移形细胞癌和肝癌等肿瘤中表达显著下降。虽然HSPD1的表达情况在多种肿瘤中存在着明显的差异，但是同时也表明HSPD1可能在肿瘤发生发展的过程中具有一定的提示作用。本研究利用蛋白质组学技术中的二维色谱-质谱联用技术分别检测了肾癌与癌旁组织中HSPD1的表达情况，发现肾癌组织中的HSPD1表达明显降低，证明肾癌组织中的HSPD1含量明显低于癌旁组织，提示HSPD1可能与肾癌的发生发展有关，但其具体机制以及其与肿瘤的临床特点、预后及进展等的相关性还需进一步研究。

[1]Ferlay J,Soerjomataram I,Dikshit R,et al.Cancer incidence and mortality worldwide:sources,methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J].Int J Cancer,2015,136(5):359.

[2]Wu YM,Liu CH,Huang MJ,et al.C1GALT1 enhances proliferation of hepatocellular carcinoma cells via modulating MET glycosylation and dimerization[J].Cancer research,2013,73(17):5580.

[3]Noh SJ,Kang MJ,Kim KM,et al.Acetylation status of P53 and the expression of DBC1,SIRT1,and androgen receptor are associated with survival in clear cell renal cell carcinoma patients[J].Pathology,2013,45(6):574.

[4]Motzer RJ,Hutson TE,Cella D,et al.Pazopanib versus sunitinib in metastatic renal-cell carcinoma[J].The New England Journal of Medicine,2013,369(8):722.

[5]Wang Q,Zhang Y,Yang C,et al.Acetylation of metabolic enzymes coordinates carbon source utilization and metabolic flux[J].Science,2010,327(5968):1004.

[6]Liu Y,Li ZX,Tan BB,et al.Identification and screening of proteins associated with gastric adenocarcinoma by proteomics based on liquid chromatography-mass spectrometry [J].Chinise General Practice,2017,20(9):1088.

[7]Xie YJ,Song L,Weng ZH,et al.Hsp90,HSP60 and sHsp Families of Heat Shock Protein Genes in Channel Catfish and Their Expression After Bacterial Infections[J].Fish Shellfish Immun,2015,44(2):642.

[8]Xu YP,Zheng GW,Dong SZ,et al.Molecular Cloning,Characterization and Expression of HSP60,HSP70 and HSP90 in the Golden Apple Snail,Pomacea canaliculata[J].Fish Shellfish Immun,2014,41(2):643.

[9]Kumar A,Ashraf S,Goud TS,et al.Exression Profiling of Major Heat Shock Protein Genes During Different Seasons in Cattle(Bos indicus) and Buffalo(Bubalus bubalis) Under Tropical Climatic Condition[J].J Therm Biol,2015,51:55.

[10]Niforou K,Cheimonidou C,Trougakos IP.Molecular Chaperones and Proteostasis Regulation During Redox Imbalance[J].Redox Biol,2014,2:323.

[11]Suliman HB,Babiker A,Wtthers CM,et al.Nitric oxide Synthase-2 Regulates Mitochondrial HSP 60 Chaperone Function During Bacterial Peritonitis in Mice[J].Free Radical Bio Med,2010,48(5):736.

[12]Arya R,Mallik M,Lakhotia SC.Heat Shock Genes-integrating Cell Survival and Death[J].J Biosci,2007,32:595.

[13]Llanos GD,Alexiou G A,Mangano A,et al.The Role of Heat Shock Proteins in Cancer[J].Cancer Lett,2015,360(2):114.

[14]ZhangZ D,Yang W,Ma F,et al.Expression of heat shock protein 27,60 and 90 in gastric cancer and its clinical value[J].Chinese Journal of Immunology,2016,7:1042.

[15]Jin S,Wang ZY,Guan FL ,et al.Expression and Significance of HSP60、HSP70 and P53 in pancreatic cancer[J].Journal of Dalian Medical University,2006,3:174.

ExpressionandSignificanceofHSPD1inRenalcellcarcinoma

YINPu,QIAOLu,YANGZhao-wei,etal.

(ClinicalTestingCenterofJilinProvince,Changchun130021,China)

ObjectiveTo investigate the expression and significance of HSPD1 in renal cell carcinoma and adjacent normal tissues.MethodsTwo-dimensional chromatography and mass spectrometry method were applied to identifying the difference of HSPD1 expressed in renal cell carcinoma and adjacent normal tissues of 10 patients with renal cell carcinoma.ResultsIdentifications by mass spectrometer showed that HSPD1 expressed significantly lower in renal cell carcinoma than that in the tissue adjacent to carcinoma,and then confirmed the accuracy by western blot.Conclusionthe decrease of HSPD1 expression may have a closely relationship with renal cell carcinoma.

HSPD1 protein;Renal cell carcinoma;LC-MS

R737.11

A

2017-01-14)

国家自然科学基金(81572082)；吉林省科学技术厅项目(2011713,20150414015GH)

*通讯作者

1007-4287(2017)10-1690-03