湖南省长沙市疾病预防控制中心（410004）汪琼 严付华 文刚

伏马毒素是由串珠镰刀菌产生的水溶性代谢产物[1][2]，由多氢醇和丙三羧酸组成结构类似的双酯化合物[2][3]。伏马毒素类似物主要以FB1、FB2、FB3形式存在。毒理学表明：伏马毒素可导致马脑白质软化症，猪肺水肿症及食道癌等疾病，是继黄曲霉毒素后又一食品安全研究热点。由于这些真菌毒素能感染大麦、玉米等作物，且可通过这些原料最终进入啤酒中，导致啤酒食品安全问题。目前我国尚未制定相关食品中伏马毒素的限量标准。因此建立一种快速、简便、准确、高效的测定啤酒中伏马毒素含量的方法尤为必要。

伏马毒素的主要检测方法有：薄层色谱法、近红外光谱法、气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法等。其中薄层色谱灵敏度较低；近红外光谱重复性较差；基于气相色谱类的方法步骤繁琐；液相色谱法需衍生，耗费溶剂较多。液相色谱-质谱法具有较高的灵敏度和选择性，无需衍生、水解，国内已有报道该法测定食品中的伏马毒素，鲜有关于啤酒中伏马毒素测定方面报道。因此本文建立免疫亲和柱净化-超高效液相色谱-质谱法测定啤酒中的伏马毒素FB1、FB2、FB3含量，为保障啤酒的安全和质量提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 H-class UPLC超高效液相-XEVO TQD串联三重四级杆质谱仪（美国Waters公司）；MultiSep® 211 Fum净化柱；0.22μm有机系微孔滤膜过滤器；伏马毒素B1、伏马毒素B2和伏马毒素B3标准品（51.1μg/mL，ROMER公司）乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯试剂（天津市化学试剂研究所）；盐酸、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾为优级纯试剂（国药集团化学试剂有限公司）；超纯水；啤酒样品购于超市。

附表1 梯度洗脱程序

附表2 3种伏马毒素质谱参考条件

附表3 各目标化合物测定的工作曲线、定量下限和检出限

附图 伏马毒素MRM图

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制 PBS缓冲溶液：称取8.0g氯化钠，0.2g氯化钾，1.2g磷酸氢二钠和0.2g磷酸二氢钾溶于990mL水中，用盐酸调节溶液pH值至7.0，加水定容至1.0L，混匀。

1.2.2 样品前处理 称取2g样品于15mL聚丙烯离心管中，超声15min，用乙腈/水溶液（50/50）定容至10mL，混匀，取上清液备用。

MultiSep® 211 Fum净化柱先用5mL甲醇和5mL甲醇/水溶液（75/25）活化，取5mL上清液过柱，10mL PBS缓冲溶液淋洗免疫亲和柱，3mL甲醇/乙酸（98/2，V/V）溶液分3次（每次1mL）洗脱免疫亲和柱，收集的洗脱液于60℃下氮吹至干，准确加入1.0mL甲醇/0.1%甲酸水（75/25）溶液溶解残留物，漩涡混匀，经0.22μm微孔滤膜过滤，待进样。

1.2.3 液相色谱条件 色谱柱：Acquity UPLC® HSS T3柱(2.1×100mm，1.8μm，美国Waters公司)；流速：0.30mL/min；流动相：A：0.1%甲酸水溶液；B：乙腈C：甲醇。柱温：40℃；进样量：10μL。流动相梯度洗脱程序见附表1。

1.2.4 质谱参考条件 电离源位电喷雾离子源，ESI+；毛细管电压：4.0KV；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：600L/H；锥孔反吹气流量：30L/H；检测方式：多离子反应监测MRM；伏马毒素B1、B2、B3及其内标物的离子对及锥孔电压、碰撞能量见附表2。

2 结果与分析

2.1 色谱和质谱条件优化 分别比较不同长度、不同粒径的色谱柱，当采用Acquity UPLC HSS T3柱(2.1×100mm，1.8μm)时，3种物质分离好，峰形尖锐，保留时间适中，能较好满足定量检测要求。为使3种伏马毒素达到基线分离，采用常用的乙腈-水、甲醇-水和乙腈-甲醇-水，在水相中添加不同浓度的甲酸，通过比较分离效果，采用乙腈-甲醇-0.1%甲酸水体系，分离度和灵敏度都能达到最佳效果。经优化流速和流动相比例，选择梯度洗脱，见附表1。优化条件下的MRM图见附图。

根据伏马毒素的分子结构特征，选用ESI+电离模式。将3种伏马毒素配置适当浓度溶液直接进质谱，分别对毛细管电压、脱溶剂温度、碰撞能量等条件进行了优化，确定3种伏马毒素的母离子和子离子，见附表2。

2.2 方法的线性范围与检出限 试验中发现样品基质对伏马毒素测定影响较小，因此采用单纯的标准品配置标准曲线。以定性离子通道中信噪比（S/N）为3时样品溶液中各毒素浓度为检测限(LOD)，以定量离子通道中信噪比（S/N）为10时样品中各毒素浓度为定量限（LOQ），见附表3。

2.3 方法回收率与精密度 对未检测出伏马毒素的啤酒样品，分别添加5.0μg/kg、10μg/kg、50μg/kg3个低中高水平浓度的伏马毒素混合标准溶液，每个水平进行6 次检测。经测定F B1回收率在82.6%～89.1%之间，FB2回收率在84.7%～86.4%间，FB3回收率在87.2%～91.5%之间；相对标准偏差RSD均＜6.1%。

2.4 样品测定 本文测定30份啤酒，其中2份中检测到FB1，且含量分别是0.410μg/kg、0.347μg/kg，其他2种毒素均未检出。

3 结论

本研究建立了检测啤酒中伏马毒素含量的液相色谱-串联质谱法，样品经乙腈提取，免疫亲和柱净化，用超高效液相色谱-串联质谱法测定。实验结果表明：该方法具有灵敏度高，分析时间短，节省流动相，环保高效，方法简单、快速、高效等优点，为检测啤酒中此类毒素提供了一种新的检测方法，同时为其他品种酒类中伏马毒素的检测提供参考。