王丽俊 王霞

(吉林农业科技学院，吉林省·吉林市，132101)

长柱金丝桃ISSR-PCR反应体系的建立与优化1)

王丽俊 王霞

(吉林农业科技学院，吉林省·吉林市，132101)

为筛选可用于长柱金丝桃遗传分析的最适ISSR-PCR反应体系，采用正交试验对影响ISSR-PCR反应的5个重要因素(Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、引物和模板DNA浓度)进行4水平正交优化，并对退火温度、循环次数进行筛选。结果表明，20 μL ISSR-PCR最佳反应体系包括Taq DNA聚合酶1.0 U、dNTPs 0.2 mmol·L-1、Mg2+3.0 mmol·L-1、引物0.4 μmol·L-1、DNA模板40 ng，对ISSR-PCR反应的影响程度由大到小为：Taq DNA聚合酶、引物、Mg2+、dNTPs、DNA模板；引物UBC822的最佳退火温度52.7 ℃，最佳循环次数41，利用优化的反应体系从61条引物中筛选出12条稳定性好、多态性高的引物，验证试验表明优化的反应体系具有较高的稳定性。

长柱金丝桃；ISSR反应体系；正交试验；引物筛选

长柱金丝桃(HypericumlongistylumOliv.)为藤黄科金丝桃属植物，俗称湖南连翘、黄海棠、红旱莲等，其花色金黄，植株秀丽，广泛分布于我国内蒙古、东北、黄河、长江、珠江流域以及朝鲜、日本等地。研究发现，长柱金丝桃富含金丝桃苷、山奈酚、槲皮素、金丝桃素、黄酮类化合物等生物活性物质，具有抗菌消炎、镇静止痛、止咳祛痰、抗抑郁、抗癌等功效[1-2]。研究长柱金丝桃种质资源的遗传多样性是对其进行种质资源保护、优良品种选育的前提和基础，目前，对长柱金丝桃的研究主要集中在药理和化学分析方面，关于遗传学方面的研究尚未见报道。

简单序列重复区间扩增(ISSR)分子标记，由简单重复序列(SSR)标记技术发展而来[3]，主要用于检测2个SSR间DNA序列的多态性，其基本原理是在SSR的3’或5’端锚定1～4个随机碱基，并以此为引物进行PCR扩增，由于SSR序列广泛分布于基因组的不同位置，因此1条ISSR引物可以扩增出多条DNA片段。……