彭宇飞，张晓峰，徐西林，马育轩，王特哈斯，李在斯，王秀珍，，5△

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040;3.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；4.北京理工大学珠海学院，广东 珠海 519088;5.黑龙江中医药大学附属第二医院哈南分院，黑龙江 哈尔滨 150000)

实验研究

中药关节腔灌注配合小针刀疗法对激素性股骨头坏死家兔病理组织学变化及TGF-β1表达影响的研究*

彭宇飞1，2，张晓峰1，徐西林3，马育轩1，王特哈斯1，李在斯4，王秀珍1，3，5△

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040;3.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；4.北京理工大学珠海学院，广东 珠海 519088;5.黑龙江中医药大学附属第二医院哈南分院，黑龙江 哈尔滨 150000)

目的：通过建立激素性股骨头坏死(SANFH)家兔模型，探讨活骨注射液髋关节注射配合针刀疗法治疗SANFH病程中股骨头局部病理组织学变化及转化生长因子(TGF-β1)表达的变化及意义。方法：选择健康成年雄性新西兰大白兔72只，采用马血清加激素法造模。造模成功后，将造模家兔随机分为模型组、针刀组、灌注组与联合组4组,每组18只。模型组与针刀组家兔双侧髋关节每日给予生理盐水关节腔注射，灌注组与联合组给予等量活骨注射液双髋关节注射治疗。各组2、5、8周各处死6只，取双侧股骨头，HE染色检测股骨头病理改变，免疫组化法检测TGF-β1蛋白表达，RT-PCT法检测TGF-β1 mRNA表达变化。结果: 联合组在SANFH治疗的过程中对股骨头病理组织学及TGF-β1的表达有影响(P<0.05)，具有统计学意义。结论:活骨注射液髋关节注射配合针刀治疗SANFH,在治疗2周后可使股骨头病理组织学发生改变，并促进TGF-β1的表达上调，其中8周达到疗效最佳。

针刀疗法;活骨注射液；髋关节腔注射；股骨头坏死；病理组织学；转化生长因子

激素性股骨头坏死(Steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH)是由于糖皮质激素大量应用引起的股骨头缺血、骨细胞大量死亡所导致的骨科常见疾病。随着医疗技术的发展和激素治疗更加广泛的应用，SANFH在非创伤性股骨头坏死中所占比重居于首位[1]。坏死早期不经有效保头治疗，致残率极高。在基于前期实验研究的基础上[2]，本课题通过活骨注射液关节腔注射配合针刀治疗对SANFH家兔股骨头病理组织学和转化生长因子(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表达影响进行研究，以进一步探讨中医药治疗SANFH的新方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验仪器：2135型切片机(德国菜卡)，电热恒温箱(上海一恒)，医用微波炉(上海一恒)，普通PCR仪(美国mj P100)，电子恒温水浴锅(北京市永光医疗仪器厂),荧光定量PCR(美国ABI 7500)，精密天平(瑞士赛多利斯)，小针刀(北京卓越华友)。

实验试剂：活骨注射液(黑龙江中医药大学制剂室)，多克隆抗兔一抗TGF-β1(北京博奥森),兔二抗PV6001(北京中山金杉生物技术有限公司)，反转录试剂盒[Takara(Japan)]，Realtime PCR试剂盒[Takara(Japan)]，DEPC(Sigma)异丙醇(上海富宇)，氯仿(上海富宇)，无水乙醇(上海富宇)。

1.2 实验动物及造模方法

选用健康成年雄性新西兰大白兔72只，体质量(3.0±0.3)kg，哈尔滨医科大学动物实验中心提供，许可证书：SYXK(黑)2014002，所有动物单笼饲养，通风，自由饮水，普通喂养。适应性喂养1周后，精确称重，参考Matsui等[3]造模方法，各家兔首次经耳缘静脉注射马血清8 ml/kg，首次注射之后间隔2周,给予第2次马血清耳缘静脉注射。第2次给药剂量为4 ml/kg。再次间隔2周，以45 mg/kg的给药剂量连续3天腹腔注射甲强龙，注射激素期间每只家兔给予青霉素8万u/只，日2次臀肌注射，预防感染。每日在家兔后肢负重状态下驱赶动物2次，造成激素型股骨头缺血性坏死家兔模型。4周后拍摄家兔髋关节MRI及股骨头病理检查，确定造模效果。

1.3 动物分组及干预

造模成功后，将造模家兔随机分为模型组、针刀治疗组(简称针刀组)、活骨注射液灌注治疗组(简称灌注组)与活骨注射液灌注治疗联合针刀治疗组(简称联合组)4组,每组18只。根据人与家兔体表面积折算的等效剂量比值换算，以此得出每只家兔双髋总给药量≈1.40 ml。以此剂量给予联合组与灌注组活骨注射液关节腔灌注治疗，模型组与针刀组家兔双侧髋关节每日给予等量生理盐水关节腔注射。注射时首先触及家兔双侧股骨大转子，以此为体表标志，向后方约0.8～1 cm处为穿刺进针点，向前内侧进针1 cm左右可有突破感，推药时阻力明显减轻，说明进入关节囊内，推入药物。

联合组与针刀组针刀治疗时，以家兔股骨大转子后内侧0.5 cm处为进针点，此处可扪及一卵圆形凹陷，为股骨头后缘与股骨颈后方形成的夹角。局麻后取1号针刀垂直刺达骨面，朝向股骨头方向钻孔，进入松质骨内前进4 mm即可退出针刀， 可在同一进针点处进行不同角度钻2～3个孔以减轻坏死区骨内压。各组分别于治疗后第2、5、8周分批处死动物。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 免疫组化检测股骨头组织中TGF-β1蛋白含量及病理组织学改变 组织经常规石蜡包埋，切片后，经无水酒精、90%、80%、70%酒精、蒸馏水各浸泡5 min，苏木素染色，酒精中分化，伊红醇溶液及无水酒精浸泡后，二甲苯两次浸泡。最后以中性树胶封片，显微镜下观察股骨头病理组织学改变。

从10%甲醛溶液中取出体积约为8 mm×8 mm×5 mm大小的组织。骨组织修块后，经脱水、透明、浸蜡和包埋后，根据TGF-β1免疫组化试剂盒说明，对TGF-β1进行检测。应用Image-pro plus6.0计算免疫组化图片IOD值，应用SPSS19.0进行数据统计分析。应用HE染色法，显微镜下观察TGFβ1蛋白表达。

1.4.2 采用PT-PCR法检测TGF-Β1 mRNA表达 取100 mg股骨头组织加入Trizol1ml以提取总RNA，逆转录所用引物序列见表1。逆转录按照: 预变性、变性、退火、延伸、重复变性、退火、再延展进行循环，共进行35个循环，充分延伸。扩增产物在琼脂糖凝胶中进行电泳，利用凝胶成像系统计算TGF-β1、GAPDH的mRNA相对含量。GSR计算方法为TGF-β1的平均密度×面积/GAPDH的平均密度×面积。

2 结果

2.1 HE染色检测股骨头病理组织学变化

2.1.1 病理观察 见图1。联合组：骨膜完整光滑，骨皮质质地均匀，软骨细胞排列整齐，骨小梁致密，软骨厚度正常、骨细胞排列整齐均匀，形态正常，软骨下血管较多，空骨陷窝形态规则，分布均匀，股骨头内骨质均匀，骨髓腔内有大量造血细胞，脂肪细胞分布均匀，血管较多。

图1 HE染色100倍镜下观察

灌注组：骨膜较完整光滑，有光泽，骨皮质质地较均匀，软骨细胞有增生，骨小梁厚度变薄，其间填充脂肪较少，形成网状，周围可见大量成骨细胞、新生血管较多，内皮细胞增生，骨陷窝较少，骨髓内有较多造血细胞，脂肪细胞形态基本正常，分布均匀。

针刀组：骨膜较完整，欠光滑，软骨表面略暗，骨皮质质地较均匀，软骨细胞有增生，骨小梁厚度变薄，部分填充脂肪，形成网状，周围可见较多成骨细胞、新生血管存在，内皮细胞增生，骨陷窝较灌注组多，骨髓内有较多造血细胞，脂肪细胞形态基本正常，分布均匀

模型组：骨膜不完整，软骨表面无光泽，软骨厚度明显变薄，厚薄不均匀，骨皮质变薄，厚度不均匀，骨小梁数量减少，变细疏松，并有断裂，骨细胞减少，软骨下血管减少，空骨陷窝形态不规则，骨髓腔相对增大，造血细胞数量减少网状结构稀疏，脂肪细胞体积增大，8周时增大较明显，血管减少。

2.1.2 空骨陷窝 骨细胞位于骨陷窝内，随着时间的推移，联合组骨陷窝明显减少，灌注组空骨陷窝呈下降趋势，针刀组和模型组的骨陷窝均呈增加的趋势，在8周时针刀组与模型组的空骨陷窝数最多，达到高峰。在相同时间点，模型组的空骨陷窝多于其他各组。联合组与灌注组、针刀组及模型组空骨陷窝数比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.2 RT-PCR检测股骨头区TGF-β1 mRNA表达情况的对比结果

结果显示：活骨注射液关节腔灌注及针刀治疗均能够显著提高SANFH兔股骨头组织中TGF-β1 mRNA的表达。联合组中表达量较其余各组差异极显著(P<0.01)。模型组2周及5周时表达量较联合组有较快上升(P<0.05)，但5～8周其上升趋势明显变缓。与模型组相比较，针刀组各时间点TGF-β1 mRNA表达始终明显较高(P<0.01),但于5周、8周上升趋势变缓。灌注组2周时与针刀组比较即有较高的表达(P<0.05),5周及8周时与针刀组比较，表达有极显著差异(P<0.01)。见表1、表3和图2。

表1 RT-PCR检测TGF-β1 mRNA表达及引物设计

图2 Realtime-PCR检测TGF-β1 mRNA

组别n2周5周8周联合组614.00±2.831)12.80±1.831)10.67±4.631)灌注组621.78±2.541)2)20.67±2.451)2)18.67±2.451)2)针刀组621.31±2.451)2)24.67±2.451)2)31.78±2.541)2)模型组623.89±5.752)31.39±5.752)44.11±4.592)

注：与模型组比较，1)P<0.05;与联合组比较，2)P<0.05

表3 各组RT-PCR检测TGF-β1 mRNA扩增结果比较

注：与模型组比较，1)P<0.05;与联合组比较，2)P<0.05;与针刀组比较，3)P<0.05

2.3 免疫组化检测TGF-β1结果

表4 各组兔不同时间点TGF-β1蛋白表达比较(IOD值

注：与模型组比较，1)P<0.05;与联合组比较，2)P<0.05

结果显示：活骨注射液关节腔灌注及针刀治疗均能够显著提高SANFH兔股骨头组织中TGF-β1的蛋白表达。联合组中TGF-β1表达量较其余各组差异显著(P<0.05)。与模型组相比较，针刀组各时间点TGF-β1蛋白表达始终明显较高(P<0.01),但于5周、8周上升趋势变缓。灌注组2周时与模型组比较即有较高的表达(P<0.05)。5周及8周时与针刀组比较，TGF-β1表达有极显著差异(P<0.01)。见表4和图3。

图3 TGF-β1免疫组化结果

3 讨论

活骨注射液是以丹参、川芎、骨碎补3味药提纯取得的中药制剂，具有活血行气、补肾强骨之功。既往研究发现，活骨注射液关节腔灌注对于ANFH具有很好的疗效。本课题的创新之处在于活骨注射液的给药方式创新性的采用中药关节腔灌注，药物直接达到病变部位，有利于发挥药物的治疗作用,腔内直接作用于支配股骨头的主要血管，使血管扩展，降低血液黏度；同时直接作用于滑膜，使滑膜的血液循环得到改善；再者，关节腔给药后关节腔内压力增髙，关节液产生压差，促进关节软骨对关节液的吸收作用，有助于药物通过软骨板向股骨头内渗透，直接作用于股骨头内的坏死区，促进新骨的生长。

TGF-β1是一种具有多种功能的多肽生长因子，可促进成骨细胞增殖与分化，也可促进骨胶原产生。TGF-β1作为参与体内生理生化、信号转导与调控的重要因子，可在调控未分化间充质干细胞增殖分化的同时，促进成骨细胞增殖、骨与血管形成。TGF-β1还具有支持破骨细胞形成、刺激骨吸收的双重作用，是骨形成和骨吸收之间重要的耦联调节因子，在股骨头坏死区修复重建的过程中，起到不可或缺的重要作用。

随着MSCs移植技术的不断提高，它已成为细胞移植治疗SANFH的理想种子，但在股骨头缺血坏死的病理条件下，坏死区血液循环受到严重破坏，MSCs在缺氧环境下大量凋亡，阻碍成骨过程。如果提高MSCs的抗凋亡能力，是股骨头缺血性坏死修复重建的重要突破。有学者研究[4-5]TGF-β1对MSCs在无氧无血清条件下凋亡的影响，结果显示：用TGF-β1预处理MSCs后，通过上调bcl-2mRNA水平抑制无氧无血清诱导的细胞凋亡。已有研究[6-7]显示活血、补肾的中药可刺激成骨细胞TGF―β1mRNA的分泌与合成。本实验结果显示，在股骨头坏死病理状态下，机体早期通过自身修复机制使TGF-β1表达上升，以促进坏死区成骨分化及破骨吸收，但随着时间的延长，模型组5～8周时TGF-β1的蛋白及mRNA表达并不再升高。提示这种机体自身修复作用是有限且受到抑制的，这可能与股骨头坏死区缺血缺氧、骨内压增高等不利于股骨头修复的因素直接相关。针刀组与灌注组TGF-β1的表达呈持续增高趋势，但灌注组TGF-β1表达始终高于针刀组(P<0.05)，提示针刀治疗及中药关节灌注治疗均能对股骨头坏死区起到修复作用。联合组TGF-β1表达明显高于其他各组(P<0.01),提示针刀联合关节腔灌注治疗能够有效促进股骨头坏死区新骨形成及破骨吸收过程，从而促进坏死区修复。

针刀疗法是结合了中医的针灸与西医手术刀两者优点于一身的一种治疗方法，在治疗ANFH时多有应用。陈关富等[8]应用针刀治疗缺血性股骨头坏死1162例，总有效率91.4%。瞿群威等[9]通过对60例FicatⅠ～Ⅱ期和Ⅲ期前期ANFH患者随机分为3组，研究针刀疗法对髋关节腔减压、骨髓腔减压和髋关节周围软组织松解的整体松解治疗对髋关节功能改善的影响，结果显示针刀整体松解治疗效果优于单纯松解关节腔或骨髓腔减压治疗。王占有等[10]将60例早、中期股骨头坏死患者随机分为治疗组与对照组，比较针刀治疗与髓芯减压治疗疗效，结果显示二者对ONFH均有治疗作用，但针刀治疗效果优于单纯髓芯减压效果(P<0.05)。针刀疗法不仅通过钻孔及切割作用起到降低骨内压及关节囊内压、促进动脉血液灌注及静脉血回流作用，更具备针灸的疏通经络、调节脏腑功能的作用，利于其内含的健康成骨细胞促进坏死区修复，激发机体自身修复功能。

本实验通过活骨注射液灌注配合针刀治疗，既能够提高TGF-β1表达，促进成骨分化以促进股骨头骨质修复，而TGF-β1又能在内环境刺激下提高VEGF表达，促进新血管生成。联合组又给予针刀减压松解，更加有利于机体修复机制发挥作用，使TGF-β1表达进一步升高,从而延长了修复作用的时间，使坏死区成骨与破骨作用相平衡，从而促进坏死区骨质的修复。

[1] 魏立友，孟和，徐文娟,等.股骨头缺血性坏死病因相关性研究[J].实用骨科杂志，2011，17(5)：423-426

[2] 刘泽霖，徐西林，张晓峰．活骨注射液治疗股骨头缺血性坏死组织形态学实验研究[J].中医药学报，2013，41(2):30-32

[3] Matsui M,Saito S,Ohzono K,et al.Experimental steroid induced osteonecrosis in adult rabbit with hypcrsensitive vasculitis[J].Clin Orthop,1992,277:61

[4] 王艾丽，陈玲玲，胡剑锋，等.TGF-β1对骨髓间充质干细胞在无氧无血清条件下凋亡的影响[J].武汉大学学报(医学版),2007,28(6)：729-732

[5] 郑丽芳，梅元武，张小乔，等.TGF-β1对MSCs体外模拟缺血性损伤的保护作用[J].青岛大学医学院学报,2008,44(6)：486-489

[6] 齐振熙，康靖东，李树强，等.活血化瘀中药对激素性股骨头缺血坏死模鼠TGF-β1表达的实验研究[J].中国骨伤,2009,22(8)：596-598

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[8] 陈关富,赖志刚,翟川江,等.针刀治疗缺血性股骨头坏死1162例临床报告[J].世界科学技术,2006,8(4)：116-119

[9] 瞿群威，陈四海，王胜成，等.针刀对股骨头缺血性坏死患者髋关节囊内压和骨内压影响的临床研究[J].针灸临床杂志,2013,29(7)：46-49

[10] 王占有，周学龙，谢利双，等.针刀与髓芯减压治疗早、中期股骨头缺血性坏死的临床随机对照研究[J].辽宁中医杂志,2016,45(5)：1055-1058

HistopathologicalChangesandExpressionofTGF-β1inSANFHRabbitsundertheTreatmentofIntra-articularInjectionofChineseMedicineCombinedwithAcupotomy

PENG Yu-fei1,2, ZHANG Xiao-feng1, XU Xi-lin3, MA Yu-xuan1, WANG Te-hasi1, LI Zai-si4, WANG Xiu-zhen1,3,5△

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;3.TheSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150001,China;4.ZhuhaiCollegeofBeijingInstituteofTechnology,Zhuhai519088,China;5.HananBranch,theSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150000,China)

Objective：To explore the changes of local histopathology and TGF-β1 in SANFH rabbits with Huogu injection combined with acupotomy.Methods72 healthy New Zealand white rabbits were modeled with horse serum and hormone. After successful modeling, they were randomly divided into the model group(n=18), the acupotomy group(n=18), the injection group(n=18), and the combination group (n=18). The rabbits in the model group and the acupotomy group were treated with saline injection into both hip joints. The injection group and the combination group were given the same amount of Huogu injection into both hip joints. Six rabbits were killed to take out the bilateral femoral heads each time at week 2, week 5, and week 8, HE staining was used to detect the pathological changes of the femoral heads. The expression of TGF-β1 protein was detected by immunohistochemistry. The expression of TGF-β1 mRNA was detected by RT-PCT.ResultsThe combination group had a significant effect on the histopathology and the expression of TGF-β1 in the process of SANFH (P<0.05).ConclusionThe treatment of Huogu injection into hip joint combined with acupotomy therapy can improve the histopathology of the femoral heads and promote the up-regulation of TGF-β1 in the treatment of SANFH after two weeks of modeling, and the best effect happened after eight weeks.

Acupotomy therapy; Huogu injection; Hip joint injection; Femoral head necrosis; Histopathology; Transforming growth factor

R246.2

A

1005-0779(2017)09-0047-05

黑龙江省自然科学基金面上项目,编号：H201467;黑龙江省博士后科研基金项目，编号：LBH-Z16194。

彭宇飞(1984-)，男，住院医师，2014级中医骨伤科学专业博士研究生，研究方向：骨坏死的中医治疗。

△通讯作者：王秀珍(1987-)，女，住院医师，黑龙江中医药大学中西医结合博士后科研流动站在站工作人员,研究方向：针药结合治疗内科疑难杂症。

2017-03-02