赵 琴， 许 静， 胡艺凡， 冯钰锜*

(1.武汉科技大学公共卫生学院，职业危害识别与控制省级重点实验室,湖北武汉 430074；2.生物医学分析化学教育部重点实验室，武汉大学化学与分子科学学院，湖北武汉 430072)

近几十年来，多环芳烃(PAHs)污染已成为众所周知的食品安全问题。在目前已发现的200多种PAHs中，苯并芘(BaP)由于其高毒性和强诱导突变性，成为被研究得最多的一种化合物[1 - 2]。我国规定，食用油中BaP的最大残留限量值为10 ng/g。食用油脂中存在大量甘油三酯和其它物质，每克油中BaP的含量低至纳克级。此外由于BaP疏水性较强，其对油脂基质具有很强亲和力，因此要想准确定量测定油脂中的BaP，其关键步骤是采用有效的样品前处理方法对油脂基质中的BaP进行分离和纯化[1 - 2]。

磁固相萃取(MSPE)采用磁性的或可磁化的材料作为吸附剂，将MSPE材料通过涡旋或振摇直接分散到样品溶液中，这种分散的萃取模式可显著增大样品溶液与吸附剂的接触面积，提高萃取率，并有益于目标分析物的快速传质，从而缩短样品前处理的时间[3 - 4]。因此，在MSPE中吸附剂材料的制备是关键。腐殖酸(HAs)是由动植物的残肢经微生物降解而产生的复杂混合物，已被证明含有烷基和芳环的骨架，并附有羧酸基、酚羟基、醌基、氨基等官能团[5 - 6]。这些特殊的分子结构使HAs易于与金属离子、氧化物以及一些有毒的有机物发生螯合作用、电荷转移作用、氢键相互作用、疏水作用以及π-π相互作用等[7 - 8]，使之在分离科学领域具有广泛的应用前景。本文将HAs直接与Fe3O4磁性纳米颗粒(MNPs)在研钵中混合研磨，在这个过程中，Fe3O4包裹粘附在微小的HAs颗粒上，从而形成磁性腐殖酸复合物(MHAs)。将制得的MHAs用于MSPE食用油中BaP，通过与高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)联用，建立了一种食用油中BaP的快速检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器及工作条件

LC-20A高效液相色谱仪(日本，岛津公司)，包括两台LC-20AD高压输液泵、DGU-20A3脱气机、RF-10AXL 荧光检测器、SIL-20A自动进样器和CTO -20AC柱温箱。色谱柱为武汉维泰克公司的HiSep C18色谱柱(150×4.6 mm i.d.,5 μm)，柱温40 ℃；流动相为88%的乙腈水溶液，流速为1.0 mL/min；激发和发射波长分别为384 nm和406 nm，进样量为10 μL。样品的红外分析由AVTAR-360红外光谱仪(Thermo Nicolet,Madison,USA)测得。

1.2 试剂

苯并芘(BaP，≥96.5%)购于Acros公司(比利时)。BaP标准溶液：将一定量BaP用色谱纯异丙醇溶解，配制成1 mg/mL储备溶液，使用时用色谱纯正己烷或异丙醇稀释至所需浓度。所有标准溶液均在-20 ℃ 冰箱中避光保存(该条件下，BaP至少能稳定保存3个月)。乙二醇、丙酮、乙二胺、FeCl3·6H2O、正己烷、NaAc均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。丙酮、异丙醇、正己烷均为色谱纯，购于Mallinckrodt Baker股份有限公司(美国)。色谱纯乙腈购于Tedia公司(美国)。三个不同批次的腐殖酸分别由国药集团化学试剂有限公司和沈阳化学试剂股份有限公司提供，使用前将腐殖酸在60 ℃下用丙酮索氏提取48 h以去除杂质。其他的试剂均直接使用，无需进一步净化。实验用水均为超纯水(美国Waters 公司生产的 Milli-Q系统制备)。

1.3 油脂样品的制备

调和油、花生油、橄榄油、亚麻油、茶籽油、椰子油、稻米油、玉米油、菜籽油、葵花籽油和大豆油，均购于武汉当地市场并于室温下避光贮藏。样品溶液为稀释的加标橄榄油溶液(0.1 g/mL)，其中BaP的加标浓度为2 ng/mL。在1 g的橄榄油中分别加入0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 ng的BaP，混合均匀后用正己烷稀释至10 mL，用以考察线性、定量限和检出限。

1.4 磁性腐殖酸(MHAs)的制备

首先采用溶剂热还原法[9]制备单分散的介孔Fe3O4纳米颗粒，主要过程如下：称取15 g FeCl3·6H2O，置于1 L的玻璃烧杯中，加入300 mL乙二醇，磁子搅拌(或超声辅助)使固体FeCl3·6H2O完全溶解于乙二醇。缓慢向上述溶液中加入45.0 g NaAc，再加入150 mL 1,2-乙二胺，强烈搅拌使形成澄清溶液。将该溶液转入聚四氟乙烯反应内胆后，密封在不锈钢反应釜中。将反应釜放入200 ℃烘箱中反应10 h。反应结束后，将生成的黑色沉淀(Fe3O4)在外加磁场下，用超纯水反复清洗多次，直至倒出的上清液无色透明为止。将该产物60 ℃下真空干燥数小时，待用。分别称取1.5 g的Fe3O4和1 g的 HAs于同一研钵中，将两种材料混合均匀并充分磨碎。在这个过程中，Fe3O4包裹并粘附在细小的HAs颗粒表面，由此HAs被赋予磁性，当MHAs分散在溶剂中时，在外加磁场下可快速地从溶液中分离。

1.5 MSPE步骤

准确称取100 mg MHAs于15 mL玻璃萃取小瓶中，先用2 mL丙酮涡旋活化2 min。倒出丙酮后，加入10 mL稀释的油样溶液(0.1 g/mL)。将该混合物涡旋5 min以形成均匀的分散溶液，在该过程中，目标物BaP通过π-π相互作用保留在萃取材料上，而油脂基质则在溶液中。在外加磁场作用下，吸附了BaP的MHAs被收集在萃取小瓶底部，移出上清液，加入2 mL异丙醇涡旋清洗30 s，以去除吸附在材料表面和瓶壁的残余油脂。弃去清洗液后，加入3 mL丙酮涡旋解吸2 min。在外加磁场下，解吸液与MHAs快速分离，并被转移至塑料离心管中，40 ℃氮吹至干。将残渣用100 μL异丙醇重新溶解定容，取10 μL进行HPLC-FLD分析。

2 结果与讨论

2.1 材料的红外光谱表征

红外光谱表征结果如图1所示，MHAs与HAs的红外谱图中出现的2 923 cm-1和2 848 cm-1为饱和烃C-H键的伸缩振动吸收峰；出现的1 708 cm-1为C=O键伸缩振动吸收峰，结合在3 440 cm-1处强吸收的宽峰，说明了羧酸基团的存在；出现在1 620 cm-1处的强吸收宽峰为芳环骨架的伸缩振动吸收峰；从900 cm-1到1 400 cm-1处的一系列吸收峰为烷烃和芳烃的C-H弯曲振动吸收峰。从图中可明显看出MHAs与HAs的特征峰基本相对应，说明本文提出的混合研磨的制备方法对HAs的性质没有明显影响，可最大程度的保留其吸附位点。

2.2 活化作用的影响

在本实验中，MHAs在萃取前首先经丙酮涡旋活化2 min。为了考察活化对萃取效率的影响，我们进行了平行对照实验，即一组MHAs经活化后，再萃取油样中的BaP；另一组MHAs不经活化，直接用于萃取BaP，如图2所示。从图中我们可以明显看出未经活化的MHAs几乎丧失了萃取BaP的能力。这可能归因于HAs特殊的结构特征：HAs表面含有大量的极性基团如羟基、氨基、羧基等，这些极性的亲水基团阻碍了疏水的油样溶液进入材料内部，导致目标物BaP无法通过π-π相互作用保留在MHAs的芳香内穴。然而，经极性溶剂活化后，残留的溶剂液膜可以帮助BaP渗透到吸附剂内部，从而提高萃取效率。在本实验中，毒性相对较低的丙酮被选作活化剂，它不但起到激活吸附剂的作用，还可进一步去除吸附在MHAs上的杂质。

图1 Fe3O4磁性纳米颗粒(a)、磁性腐殖酸(b) 和腐殖酸(c)的红外(IR)光谱图Fig.1 IR spectra of MNPs(a),MHAs(b) and HAs(c)

图2 丙酮活化对萃取效率的影响Fig.2 The effect of activation with acetone before MSPE

2.3 MSPE条件的优化

本文将商品化HAs通过与MNPs共混研磨，制备成MHAs用于MSPE食用油中BaP，优化了一系列可能影响MSPE萃取性能的参数。在优化实验中以将加标的稀释油样(2 ng/mL)作为基质，每个条件均平行进行三组实验。

2.3.1吸附剂的用量为了保证足够的萃取回收率，我们将吸附剂的用量从25 mg逐渐增加至125 mg。实验结果如图3(a)所示：当吸附剂用量从25 mg增加至100 mg时，回收率明显提高，继续增加吸附剂的用量，回收率没有明显变化。因此，在后续实验中，将吸附剂用量固定在100 mg。

图3 吸附剂用量(a)、解吸溶剂体积(b)、萃取时间(c)和解吸时间(d)对回收率的影响Fig.3 The Effect of amont of sorbent(a),volume of desorption solvent(b),extraction time(c) and desorption time(d) on the extraction efficiency The oil sample solutions with BaP spiked at 2 ng/mL were prepared by diluting 1 g edible oil to 10 mL with n-hexane.

2.3.2解吸液的体积解吸液的体积直接影响解吸效率。在本实验中，毒性相对较低的丙酮被选作解吸液，其可有效地将吸附在MHAs上的BaP洗脱下来。为了考察丙酮体积对回收率影响，我们分别采用不同体积的丙酮作为解吸液(0.5、1、2、3、5、8 mL)。结果(图3(b))表明3 mL的丙酮足够将MHAs上吸附的BaP完全洗脱。由于目标分析物BaP在解吸溶液中浓度较低，因此在进样前将解吸液在温和氮气流下蒸发至近干，然后用100 μL异丙醇重新溶解，这样可以有效提高检测灵敏度。

2.3.3萃取和解吸时间在本实验中，萃取和解吸时间的考察范围均为1～10 min。结果表明，当萃取时间从1 min增至5 min时，萃取效率提高，但继续增加涡旋时间对回收率没有明显影响(图3(c))，因此萃取时间定为5 min。此外，当解吸时间从1 min增加到10 min时，未观察到回收率有明显变化(图3(d))，因此解吸时间设为2 min。本实验中，快速的萃取和解吸过程归功于MSPE分散的处理模式，其有效增大了样品溶液和吸附剂之间的接触面积，促进了目标分析物的传质，使得萃取和解吸平衡可在短时间内到达。

2.4 方法学考察

在上述优化的条件下，考察了线性、检出限(LOD)、定量限(LOQ)、精密度以及加标回收率以验证该方法在实际应用中的可行性。以低温初榨的橄榄油为样品基质，添加不同浓度的BaP(每个浓度平行三组实验)，以得到的平均峰面积对样品浓度进行线性回归，得到线性回归方程及相关系数。结果表明目标物BaP在0.1～100 ng/g范围内线性关系良好，相关系数R为0.999。以信噪比为3计算得BaP的检出限0.04 ng/g；以信噪比为10计算得定量限为0.13 ng/g。线性回归、检出限和定量限数据列于表1。

表1 方法线性范围、线性参数、检出限及定量限Table 1 The linear range,regression data,limit of detection(LOD),limit of quantification(LOQ) for the determination of BaP in oil samples

我们在橄榄油中分别添加低(1 ng/g)、中(5 ng/g)和高(10 ng/g)三个浓度的目标分析物。在1 d内单独配制5组平行样品并进行萃取，计算得日内相对标准偏差(RSD)；以连续3 d，每天配制3组平行样品并进行萃取测定，计算得日间RSD。结果表明日内和日间RSDs分别小于3.5% 和15.8%，说明所建立的方法重现性良好，见表2。

表2 苯并芘日内日间精密度Table 2 Precisions for the determination of BaP at three different concentrations in oil samples

2.5 实际样品中的应用

为了考察我们建立的方法的普适性，将该方法应用到多种常见的食用油中进行验证。结果如表3所示，所有食用油中均含有一定量的BaP，浓度从0.17 ng/g至8.16 ng/g。7种食用油中检测到的BaP的色谱图见图4。对12种油样的加标回收率为74.2%～120.6%，RSD<11.0%。说明发展的方法具有良好的普适性，可用于多种食用油中BaP的检测。

表3 常见食用油中苯并芘的检测结果(n=3)Table 3 Concentrations,recoveries and precisions of BaP in several real samples(n=3)

Note:The concentrations of the spiked BaP were 5 ng/g.

3 结论

制备了MHAs复合材料，并将其作为MSPE的萃取剂用于快速分离和富集食用油脂中的BaP。该制备过程简单，不涉及任何化学反应步骤，避免了有机溶剂的使用，绿色环保。结合HPLC-FLD分析，建立了食用油中BaP 的检测方法，该方法简单，高通量，低消耗。在优化的条件下，该方法检出限为0.04 ng/g，低于大多数已报道的检测方法，并且准确度和重现性良好。另外，MHAs在样品前处理中展现出应用潜力，其独特而直接的制备方法可扩展至其它磁性材料的制备。