张伟+陈瑞超+芦锦

摘 要： 丁基胶塞作为常用药品包材，无论是生产还是使用阶段均会与药品产生直接接触，为保证其质量达标，必须要对其进行热源检查。而在实际检查中，为避免热源法敏感度对最终检查结果准确性的影响，多选择应用细菌内毒素检查法处理，具有更高的灵敏性。本文主要以丁基胶塞作为对象，对其细菌内毒素检查方法要点与控制措施进行了简单分析。

关键词： 丁基胶塞；细菌；内毒素检查

丁基胶塞具有较强的化学稳定性、气密性、洁净性以及生物性，是比较常见的药品包材，但是因为配方复杂性以及原材料所选不同，会存在部分活性较强的分在封装后与药品产生反应，出现胶塞与药物之间的相容性问题。为确保所用丁基胶塞质量达标，需要对其进行细菌内毒素检查，确认是否存在细菌内毒素污染情况，保证药品、器械的安全性。

一、细菌内毒素检查法原理

细菌内毒素为与革兰阴性菌细胞壁相关的一种热原物质，也是目前发现普遍处于水溶液容重的热原，可以作为药品安全性检查的重要指标。细菌内毒素多由革兰阴性菌产生，为细胞壁最外层部分脂多糖，同时含有亲水多糖链与输水脂肪酸链，使其在水溶液内具有自然聚集成团特点。表现在机体上，如致死毒性、发热性、体重减轻、白细胞减少等；表现在细胞水平上，如阻止巨噬细胞游走以前列腺抗肿瘤坏死等。基于其特性，可以通过细菌内毒素检查法确认药品质量是否达标，对比传统家兔热原检测方法，此种检查方法具有更大应用优势，检查结果也更为精确[1]。检查时主要是利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝聚反应机制，确认试验品细菌内毒素限量是否合理，主要包括凝胶法与光度测定法两种，且光度测定法又可分为浊度法与显色基质法，现在在实际应用中标准化程度不断提高。

二、细菌内毒素检查影响因素

在应用细菌内毒素检查方法时，需要保证试验过程的无菌性，全程采取无菌操作，避免微生物对供试品产生影响，而降低检查结果准确性。因此，在试验前需要对实验室进行全面清洁，并利用紫外灯持续灭菌1h，然后在百级净化台上实验操作，尽量减小动作幅度，最大程度上来避免试管的振动。另外，还要提前准备好实验所需的各项器皿，并全面清洁消毒，确保不存在外源性内毒素，一般可将其置于250℃条件下持续干烤60min[2]。以凝胶法实验过程为例，要求细菌内毒素检查用水内毒素含量在0.015ml～1之间。部分供试品还要进行复溶、稀释处理，或者是在水性溶液内浸提制成供试品溶液，并控制溶液pH在6.0～8.0之间，确保可以正常凝聚。就以往经验来看，溶液pH值过高或过低均会对部分内毒素产生损坏，降低鲎试剂与内毒素发生的聚集效果。而对于自身酸碱性较大，或者具有缓冲能力的供试品，需要提前对被测溶液pH进行调整，将其控制在技术要求范围内。其中，在对溶液进行稀释时，可以利用漩涡混合器，促使溶液均匀混合，尽量避免出现假阳性或者假阴性结果，提高检查结果的准确性与代表性。

三、丁基胶塞细菌内毒素检查实验

1.实验准备

1.1仪器

电热恒温水浴箱与涡轮混合器，数量若干的玻璃器皿，且要对所有玻璃用具进行250℃条件下的1h干热灭菌，以免存在外源性内毒素。

1.2试剂

灵敏度为0.5EU/mL的鲎试剂，为保证实验结果的准确性，可以分别选择同灵敏度的多种批号试剂。还需要提前准备好效价为150EU/支的细菌内毒素工作标准品，细菌内毒素检查用水以及注射用卤化丁基胶塞[3]。

2.实验方法

2.1 灵敏度复核

以《中国药典》相关规定与资料作为依据，对鲎试剂进行灵敏度复核，可得三种不同批号的鲎试剂灵敏度均符合要求。

2.2制备浸提液

在制备浸提液时，需要保证全程无菌操作，排除微生物对试验结果的影响。选取3支相同批号的注射用卤化丁基胶塞，然后用纯化水将其冲洗干凈，用滤纸吸收剩余水分，放置到250mL的广口瓶内并加塞处理，最后将广口瓶放入压力蒸汽灭菌器内，保持115℃条件持续灭菌30min。灭菌结束后按照表面积加入50mL细菌内毒素检查用水，确保能够将胶塞全部浸没，重新将广口瓶加塞密封，后放置于37±1℃恒温水浴内保温72±2h。其中，在保温阶段还需要进行数次振荡处理，避免产生微生物。保温时间结束后取出冷却，作为注射用卤化丁基胶塞的浸提液。

2.3预干扰试验

按照样品表面积：水为1：0.5比例选取注射用卤化丁基胶塞浸提液，并用细菌内毒素检查用水稀释，获得1：0.5、1：1、1：2、1：3、1：4功5种浓度的溶液。利用细菌内毒素检查用水来对细菌内毒素进行稀释，得到0.25λ、0.5λ、λ、2λ共4种浓度溶液[4]。然后利用细菌内毒素标准品配置不同浓度的样品阳性液，按照专业标准进行预干扰试验。

2.4供试品干扰试验

根据《中国药典》内容进行供试品预干扰试验，即选择细菌内毒素检查用水与注射用卤化丁基胶塞浸提液，加入到同支细菌内毒素溶液内，且每一个浓度均需要做4管平行试验。然后选择细菌内毒素工作标准品0.25λ、0.5λ、λ、2λ的细菌内毒素溶液，同样每一浓度做4管平行试验。另外，对细菌内毒素检查用水以及注射用卤化丁基胶塞浸提液做2管阴性对照试验。最大浓度2.0λ均设定为阳性，最低浓度0.25λ则均为阴性，按照工程En=lg（∑X/4）计算，分别确定细菌内毒素检查用水与注射用卤化丁基胶塞浸提液所制细菌内毒素标准溶液的反应终点几何平均值En与Et，其中X表示细菌内毒素检查用水或者注射用卤化丁基胶塞浸提液制成的细菌内毒素标准溶液反应终点浓度对数值。当En处于0.5λ～2.0λ时，Et在0.5En～2.0En时，确认注射用卤化丁基胶塞浸提液不干扰试验。

3.结论分析

经过试验后可以确定，0.5EU/支的鲎试剂作为干扰试剂时，Et值在0.5En～2.0En范围内，即注射用卤化丁基胶塞浸提液不会对细菌内毒素试验产生干扰，确定细菌内毒素检查法对丁基胶塞的热原检查可行。

结束语：

应用细菌内毒素检查法来确定丁基胶塞质量是否达标，对比以往检查方法其具有更大的优势，但是整个过程要做好细节管理，消除各类因素的影响，保证检查结果的可靠性。■

参考文献

[1] 裴宇盛，蔡彤，高华.细菌内毒素检查新方法进展[J].药物分析杂志，2014，（03）：392-395.

[2] 肖贵南，孙清萍，盛英美.如何建立新药的细菌内毒素检查方法[J].中国医药导报，2011，（32）：159-160+162.

[3] 张义伟.细菌内毒素检查的几点体会[J].中国实用医药，2010，（03）：86-87.

[4] 张之奎，梁风芹，辛国忠，于文胜，郑勇强.注射用卤化丁基橡胶塞的细菌内毒素检查法[J].中国药业，2007，（02）：41-42.