蒋飞黔（四川大学，生物治疗国家重点实验室，四川 成都 610041）

Plackett-Burman和响应面法优化CHO细胞无血清培养基中关键营养成分

蒋飞黔（四川大学，生物治疗国家重点实验室，四川 成都 610041）

为了提高CHO细胞在无血清培养基中的生长和蛋白表达能力。通过文献选择16种物质，利用Plackett-Burman实验法筛选有出显著影响的4种营养物质，再使用中心复合设计响应面法优化各成分含量，得到最优配比为腐胺0.07mg/L、柠檬酸铁132.5mg/L、磷酸二氢钠0.84mg/L和烟酰胺2mg/L，优化后获得无血清培养基性能优于同类商品化培养基。

Plackett-Burman；响应面；CHO细胞；无血清培养基

中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary，CHO）是目前生产重组蛋白的主要宿主细胞，广泛应用于药物生产领域。CHO细胞表达系统能很好的指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的糖基化等修饰和加工；其表达蛋白的理化性质、分子结构及生物学活性等接近天然的生物蛋白分子[1]。CHO细胞无血清培养基是在DMEM∕F12基础上添加生长因子、氨基酸、维生素和微量元素等组成[2]，能减少生产难度也能稳定产品质量。

本研究目的是开发CHO细胞无血清培养基用于表达VEG⁃FR-FC融合蛋白，其作用为抑制肿瘤部位的血管新生而达到治疗目的。本实验以细胞生长状态和表达量为评价指标，通过Plackett-Burman法筛选关键成分再使用响应面法优化其中含量[3-4]。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞

CHO细胞，表达VEGFR-FC。

1.1.2 试剂

DMEM∕F12基础培养基购自Gbico公司；营养物质购自Sig⁃ma-Aldrich公司。

1.1.3 设备与仪器

二氧化碳培养箱，Kuhner公司ISF1-X；细胞计数仪，Beck⁃man公司ViCell Counter；高效液相色谱仪，Agilent公司1200。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

细胞复苏后离心重悬至摇瓶培养，每培养72h时取样计数，按稀释密度3-5×105cells∕mL再次传代；随后按实验设计接种至250mL摇瓶，每瓶培养体积50mL，培养条件：温度36.5℃、CO2浓度5%。

1.2.2 Plackett-Burman实验设计

通过查阅文献汇总了对细胞生长与表达影响较大的16个主要营养成分，增加2个虚拟变量考察误差，各因子信息见表1。采用Plackett-Burman实验设计方法安排20次实验。

表1 Plackett-Burman设计因子及浓度

1.2.3 响应面设计

经筛选实验后分析结果，采取蛋白产量优先，活细胞密度其次的选择策略共得到4个关键因子：腐胺、柠檬酸铁、磷酸二氢钠和烟酰胺，参考表1中因子含量水平并扩大±0.5倍浓度进行响应面分析。采用中心复合设计方法共设计30次实验。

2 结果与分析

2.1 主要营养物质筛选

Plackett-Burman实验结果见图1并利用Minitab统计软件进行方差分析，由于实验设计中包含混杂和摇瓶实验存在误差，故显著性水平设定为0.1。分别以蛋白表达量和最高活细胞密度为响应，初筛得到关键影响营养因子为：腐胺、柠檬酸铁、磷酸二氢钠和烟酰胺。

图1 Plackett-Burman实验结果

图2 响应面实验设计和结果

2.2 响应面实验结果分析

响应面实验结果见图2，利用Minitab统计软件进行GLM拟合和方差分析。结果中以活细胞密度为响应的模型失拟项PValue=0.893，以蛋白表达量为响应的模型失拟项P-Value=0.815，说明拟合结果均可用。

得到活细胞密度和蛋白表达量的拟合二次方程如下：

图3 各组分对活细胞密度的响应图

图4 各组分对蛋白表达量的响应图

对两组回归方程做等高线响应图分别见图3、图4。图3显示B、C项对活细胞密度有显著影响，A与C项存在较强的交互作用；图4显示A、B、D和C依次对蛋白表达有显著影响，A与D项存在较强的交互作用。

组合两组回归方程以最大值为目标求解可得，当A（腐胺）=0.07mg∕L、B（柠檬酸铁）=132.5mg∕L、C（磷酸二氢钠）=0.84mg∕L、D（烟酰胺）=2mg∕L时活细胞密度和蛋白产量最高，其预测值为活细胞密度38.23×105cells∕mL，蛋白表达量236.85mg∕L。

3 结语

无血清培养基中通常以商业化DMEM∕F12作为基础，组合不同营养成分取代血清来满足细胞生长。但由于成分众多且复杂对细胞生长和代谢的影响是不同的，通过文献选取其中16种物质，经过筛选和评估实验后发现其中腐胺、柠檬酸铁对细胞生长有显著的促进作用，而腐胺、柠檬酸铁、烟酰胺和磷酸二氢钠对细胞蛋白表达促进作用依次增大。优化含量后所获得的自研无血清培养基能较好的满足CHO细胞生长和表达，其性能可达到或优于商品化培养基。

结果证明，Plackett-Burman实验设计和响应面优化法相结合的统计方法能快速、有效地筛选出能影响CHO细胞生长与表达的营养因子，并能通过优化得到最佳成分配比。最终能增加CHO细胞蛋白表达量也有利于减低生产成本。

[1]刘定燮周晓巍黄培堂.哺乳动物细胞表达系统及其研究进展[J].生物技术通讯,2003,04:308-311.

[2]Huang Y M,Hu W,Rustandi E,et al.Maximizing produc⁃tivity of CHO cell-based fed-batch culture using chemically de⁃fined media conditions and typical manufacturing equipment.[J].Biotechnology Progress,2010,26(5):1400.

[3]Chun C,Heineken K,Szeto D,et al.Application of Factori⁃al Design to Accelerate Identification of CHO Growth Factor Re⁃quirements[J].Biotechnology Progress,2003,19(1):52-7.

[4]Vohra A,Satyanarayana T.Statistical optimization of the medium components by response surface methodology to enhance phytase production by Pichia anomala[J].Process Biochemistry,2002,37(9):999-1004.