谭永安，肖留斌，郝德君，赵静，孙洋，柏立新



绿盲蝽AlEcR-A的单克隆抗体制备及在外源20E诱导下的应答

谭永安1，肖留斌1，郝德君2，赵静1，孙洋1，柏立新1

（1江苏省农业科学院植物保护研究所，南京 210014；2南京林业大学林学院，南京210037）

【目的】获得绿盲蝽（）蜕皮激素受体（）原核表达的重组蛋白，制备单克隆抗体，分析绿盲蝽在外源蜕皮激素(20E)诱导下mRNA及蛋白表达量的变化趋势，为进一步研究的功能奠定前期基础，同时也为构建20E信号传导的网络图谱提供理论依据。【方法】在前期获得绿盲蝽的基础上，将含有其基因的T载体经I和I双酶切，构建AlEcR-A原核表达载体（pCzn1-AlEcR-A），将该表达载体经IPTG诱导表达和蛋白Ni-IDA亲和纯化，以获得基因功能区的纯化蛋白。进一步用其进行免疫反应，取小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合，采用间接ELISA及Western blot筛选验证是否为目的抗体，通过抗体纯化，Western blot检测该抗体能否特异性结合AlEcR-A重组蛋白及绿盲蝽总蛋白，从而制备得到AlEcR-A蛋白单克隆抗体。最后利用RT-PCR及Western blot方法，进行20E微注射绿盲蝽2龄若虫，分析8 d内的mRNA及蛋白含量的变化，明晰20E诱导下的应答反应。【结果】 经I和I双酶切后原核表达载体pCzn1-AlEcR-A在大肠杆菌Arctic express中能高效表达一个约为55 kD的蛋白，且该重组蛋白经IPTG诱导后主要以包涵体的形式存在；经Ni-IDA亲和层析后，pCzn1-AlEcR-A重组蛋白的包涵体纯度仅在55 kD附近有一条明显的特异性条带，说明靶蛋白已得到纯化。进一步通过小鼠免疫、细胞融合及腹水制备，获得了1株能稳定分泌抗AlEcR-A蛋白单克隆抗体的细胞株，命名为8H7；……