付晶晶, 杨彩霞, 韩 彤, 廖一鸣, 李 梁, 李梦新, 孙 伟, 王 蒴(.沈阳大学生命科学与工程学院，辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点实验室，辽宁 沈阳 0044；.沈阳农业大学分析测试中心，辽宁 沈阳 0866)

小西葫芦黄花叶病毒辽宁分离物的鉴定与序列分析

付晶晶1, 杨彩霞1, 韩 彤1, 廖一鸣1, 李 梁1, 李梦新1, 孙 伟1, 王 蒴2
(1.沈阳大学生命科学与工程学院，辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点实验室，辽宁 沈阳 110044；2.沈阳农业大学分析测试中心，辽宁 沈阳 110866)

从辽宁省沈阳市和盖州市分别采集表现花叶的南瓜样品,经透射电镜负染色实验，观察到典型的马铃薯Y病毒属(Potyvirus)线状病毒粒子.利用Potyvirus通用引物LegpotyF/LegpotyR分别对3个沈阳样品和3个盖州样品进行RT-PCR扩增，得到预期片段，克隆并测序.Blast显示6个病毒样本与小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)同源性最高，均大于99%.利用已经报道的特异引物ZYMV-F/ZYMV-R，从6个样本中扩增到约1.2 kb的ZYMV片段，片段包含完整的外壳蛋白(CP)基因.基于CP的核苷酸序列同源性分析，发现2个ZYMV辽宁分离物与山西分离物ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14](KP742962)同源性最高，达99.1%和99.4%.系统进化树分析表明，2个ZYMV辽宁分离物与山西分离物ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14]聚集在一个分支，推测ZYMV辽宁分离物与山西分离物亲缘关系最近.

小西葫芦黄花叶病毒; 辽宁分离物; 序列分析

Abstract:Cucurbitamoschatasamples showing yellow mosaic symptoms were collected from Shenyang and Gaizhou, Liaoning Province, and virions with a typical morphology ofPotyviruswere observed by transmission electron microscope (TEM). The universal degenerate primers LegpotyF/LegpotyR was used forPotyvirusesdetection for 3 symptomatic leaf samples from Shenyang and Gaizhou by RT-PCR. Subsequently, the expected fragments were amplified, cloned and sequenced. Blast results showed that all 6 samples shared the highest identities withZucchiniyellowmosaicvirus(ZYMV) (all above 99%). Based on specific primers ZYMV-F/ZYMV-R， 1.2 kb ZYMV fragment containing complete coat protein (CP) gene was obtained. Referring to the nucleotide sequence ofCP, homology analysis results confirmed that two Liaoning isolates of ZYMV had the highest homology with Shanxi isolate ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14] (KP742962), with identity being 99.1% and 99.4%. The phylogenetic tree results showed that they were also clustered with ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14] in the same branch. Liaoning isolates of ZYMV was considered being most related to Shanxi isolates.

Keywords:Zucchiniyellowmosaicvirus; Liaoning isolate; sequence analysis

小西葫芦黄花叶病毒(Zucchiniyellowmosaicvirus, ZYMV)是马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus，也为PotatovirusY,PVY)的成员[1]，病毒粒子为弯曲线状，无包膜，长度为750 nm.基因组为长9.5 kb的单链正义RNA(positive single-stranded RNA, +ssRNA)，5′端具有一个共价结合基因组连接蛋白(viral protein genome-linked, VPg)，3′端为20～160 nt个腺苷酸组成的Poly(A)尾巴[2].基因组编码一个350 kD的多聚蛋白(polyprotein)，翻译后加工切割成解旋酶、复制酶和衣壳蛋白等8～10个蛋白参与病毒的复制、运动和包装[3].目前，研究较深入的是ZYMV的衣壳蛋白(coat protein,CP)，发现CP除了参与病毒的组装，还参与病毒转录、移动和介体传播[4].在田间，ZYMV主要以蚜虫经非持久性方式进行传播[5-7]；自然寄主范围广泛，可侵染西葫芦、南瓜、西瓜、罗汉果、黄瓜、甜瓜、冬瓜、丝瓜、节瓜、瓠瓜、苦瓜、香瓜等葫芦科植物[8-13]，常造成叶片坏死、褪绿或黄斑驳以及果实畸形等症状，严重影响作物的产量和商品价值[14-15].近年来，ZYMV已在我国迅速蔓延，在北京、山东、湖南、江苏、广西、广东、甘肃和新疆等地广泛发生危害[8,10,13,16-20]，但尚未见其在辽宁发生的相关报道.2016年，笔者在辽宁沈阳和盖州地区均发现疑似病毒侵染的南瓜样品，通过透射电镜观察和分子检测，明确侵染南瓜的病毒种类，并分析其分子特征，以期为该病害的防治提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

2016年8月，从辽宁省沈阳市和盖州市采集表现花叶症状的南瓜样品，保存于-80 ℃超低温冰箱备用.

1.2 方法

1.2.1 透射电镜观察 取典型花叶症状的新鲜叶片，置研钵中，加少量磷酸盐缓冲液(phosphate buffer, PB)，研磨至匀浆状，6 000 r·min-1离心3 min.取上清，铜网置其中吸附3 min后，于2%磷钨酸中染色10 s，置于透射电镜(Hitachi TEM system)下观察.

1.2.2 植物总RNA的提取及病毒的RT-PCR检测 利用RNASimple Total RNA Kit提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取南瓜病叶总RNA后，在Oligo(dT)15引物引导下，采用TIANScript RT Kit[天根生化科技(北京)有限公司]进行第一链cDNA的合成.具体操作：取总RNA 3 μL、Oligo(dT)15(10 μmol·L-1) 2 μL、Super Pure dNTPs (2.5 mmol·L-1each) 2 μL，补RNase-Free ddH2O至14.5 μL后混匀，置于70 ℃金属浴加热5 min，迅速在冰上冷却2 min；短暂离心后加入TIANScript M-MLV反转录酶(200 U·L-1) 1 μL、RNase抑制剂(20 U·μL-1) 0.5 μL、5×First-Strand Buffer 4 μL，混匀后42 ℃ 50 min，90 ℃ 5 min终止反应，置冰上冷却后加入RNase-Free ddH2O至50 μL备用.

以cDNA作为模板，先后用Potyvirus检测通用引物[11]PVY-LegpotyF (5′-GCWKCHATG ATYGARGCHTGGG-3′)/PVY-LegpotyR(5′-AYYTGYTYMYCHCCATCCAT-3′)和ZYMY特异性引物[20]ZYMV-F(5′-AAGAAGAAGTGCGAGAATTGG-3′)/ZYMV-R(5′-CTTTACGCTTTAAAGGTGGGA-3′)进行PCR扩增(引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成).PCR反应体系为25 μL，循环参数：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，35个循环，72 ℃延伸10 min.将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用TIANgel Midi Purification Kit[天根生化科技(北京)有限公司]对目的DNA条带进行回收和纯化.回收产物与pMD18-T[宝生物工程(大连)有限公司]克隆载体于16 ℃连接1 h后，转入DH5α菌株的感受态细胞进行过夜培养.挑取单菌落，280 r·min-1、37 ℃摇床培养7 h，取3 μL菌液进行PCR鉴定.阳性样品送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序.

1.2.3 序列分析 测序结果及数据处理等借助DNAStar (DNASTAR Inc., Madison, USA)和DNAMAN version 6.0 (Lynnon Biosoft, Quebe Canada)软件完成.利用NCBI (National Center for Biotechnology Information)数据库的BLAST程序(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索同源序列.采用DNAStar的Clustal V程序分析同源性.利用Clustal_X version 1.83[21]进行完全比对后再用软件MEGA version 7.0[22]的最大似然法绘制亲缘关系树，置信度设置为1 000，分支节点上的数值为后验概率(>50%).

2 结果与分析

2.1 南瓜病叶样品电镜观察结果

新鲜南瓜病叶于透射电镜下进行病毒粒子的负染色观察，可见750 nm×13 nm的线性粒子，病毒粒子外表面无包膜(图1).病毒粒子形态特征显示该病毒可能为Potyvirus属成员.

2.2 RT-PCR检测结果

利用属通用引物PVY-LegpotyF/R对南瓜病叶的cDNA扩增得到701 bp的特异性片段，而健康南瓜叶片中未检测到该片段(图2A).测序结果显示该片段与ZYMV高度同源.利用ZYMV特异性引物ZYMV-F/R对南瓜样品扩增，获得包含完整CP基因的长约1.2 kb的片段(图2B).

图1 南瓜病叶中的线性病毒粒子Fig.1 Filamentous virion detected in diseased pumpkin leaves

A:PVY-LegpotyF/R引物的扩增结果；B:ZYMV-F/R引物的扩增结果.M：Marker DL2000；1～3：沈阳样品；4～6：盖州样品；7：健康样品；CK：水.图2 南瓜病叶ZYMV的RT-PCR检测结果Fig.2 Detection of ZYMV in diseased pumpkin leaves by RT-PCR

2.3 序列分析

经Blast比对，PVY-LegpotyF/R扩增片段与ZYMV的一致性为91%～97%，该片段含有部分CP基因.ZYMV-F/R扩增片段含有849 nts的CP基因(GenBank登录号为KY495594-KY495599)，编码282个氨基酸.6个分离物的同源性高达99.8%，选取ZYMV-LNsyA和ZYMV-LNgzA分离物进行同源性和系统进化分析.同源性分析显示，它们均与ZYMV的中国山西菊花分离物ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14](KP742962)同源性最高，分别达99.1%和99.4%(表1).

表1 ZYMV 2个辽宁分离物与其他报道ZYMV分离物的CP基因的核苷酸序列同源性Table 1 Percentage of nucleotide sequence identity between CP gene of 2 Liaoning isolates and other published ZYMV isolates

续表1

基于CP基因构建系统进化树，ZYMV-LNsyA和ZYMV-LNgzA与中国山西菊花分离物ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14](KP742962)、韩国西葫芦分离物ZYMV-[SK:Cucurbitapepo](AB369279)、韩国黄瓜分离物ZYMV-[SK:Cucumber](AF062518)、中国山西南瓜分离物ZYMV-[CN:SX:Squash](AY61102-AY611024)、韩国南瓜分离物ZYMV-[SK:Cucurbitamoschata](AY278998-AY279000)和中国河南甜瓜分离物ZYMV-[CN:HN:Melon](AY611022)聚集在第Ⅲ簇；第Ⅰ簇分离物最多，包括欧洲分离物(塞尔维亚、法国和德国)、南美分离物(委内瑞拉)、澳洲分离物(澳大利亚)和亚洲分离物(伊朗、以色列、叙利亚、印度和巴基斯坦)；第Ⅱ簇分离物主要来自欧洲(波兰和意大利)、非洲(马里和南非)和亚洲(中国和日本)；第Ⅳ簇分离物均来自中国台湾和中国浙江；第Ⅴ簇是2个新加坡分离物；PMMV-[CN:LN](KU646837)作为外群组单独成一个分支(图3).Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ簇均为亚洲分离物，主要来自中国、韩国和新加坡.亚洲其他地区(日本、印度、伊朗、以色列和巴基斯坦)分离物与欧洲、非洲、美洲和澳洲分离物聚集在Ⅰ和Ⅱ簇中.可见，ZYMV没有明显的地理和寄主限制.

图3 基于2个ZYMV辽宁分离物及42个已报道ZYMV CP核苷酸序列构建的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on CP nucleotide sequences of 2 ZYMV Liaoning isolates and 42 previously reported ZYMV isolates

根据第九次病毒分类委员会报道的Potyvirus分类标准(CP基因的核苷酸同源性低于76%，或者CP基因的氨基酸同源性低于80%，可认为是PVY属的一个新种)[1]，可判定侵染辽宁沈阳和盖州地区南瓜的病菌为小西葫芦黄花叶病毒(Zucchiniyellowmosaicvirus, ZYMV).

3 讨论

Potyvirus是Potyviridae中最大的属，包含143个确定种和32个暂定种[1].目前，辽宁仅报道了西瓜花叶病毒(Watermelonmosaicvirus, WMV)西瓜分离物[23]、PVY烟草分离物[24]、甘薯褪绿矮化病毒(Sweetpotatochloroticstuntvirus, SPCSV)甘薯分离物[25]和百合斑驳病毒(Lilymottlevirus, LMoV)百合分离物[26]，尚无ZYMV的相关信息.ZYMV主要危害瓜类葫芦科作物[8-13]，而瓜类作物又是辽宁省农民增收的重要产业(种植面积约13.3万hm2，产值约100亿元)[27]，因此，有必要对ZYMV病害进行调查和检测，为该病害的防治提供理论基础.本研究首次确定辽宁沈阳和盖州地区普遍发生的花叶南瓜上存在ZYMV，并基于CP核苷酸将ZYMV划分为5个基因型，其中,辽宁分离物属于Ⅲ型，而Ⅳ型基因是中国特有群体.目前，ZYMV中国分离物的基因分型均基于CP的系统进化分析[10,17,19-20]，如赵芹等[19]将ZYMV划分为7个基因型，而李继洋等[20]将ZYMV划分为4个基因型.更准确的基因型划分，将需要庞大的ZYMV分离物信息，因此，今后将继续对辽宁地区ZYMV病害进行系统调查和检测.

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(责任编辑:杨郁霞)

IdentificationandsequenceanalysisofZucchiniyellowmosaicvirusinLiaoning

FU Jingjing1, YANG Caixia1, HAN Tong1, LIAO Yiming1, LI Liang1, LI Mengxin1, SUN Wei1, WANG Shuo2
(1.Liaoning Key Laboratory of Urban Pest Management and Ecological Safety, College of Life Science and Bioengineering, Shenyang University, Shenyang, Liaoning 110044, China; 2.Forecasting and Analysis Center, Shenyang Agricultural University, Shenyang, Liaoning 110866, China)

S432.1

A

1671-5470(2017)05-0488-07

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.05.002

2017-01-25

2017-04-11

辽宁省自然科学基金(2015020806)；辽宁省教育厅一般项目(L2015362)；辽宁省博士科研启动基金(20121043)；沈阳大学博士科研启动基金(20212365).

付晶晶(1993-)，女，硕士研究生.研究方向：植物病毒学.Email:343876551@qq.com.通讯作者杨彩霞(1980-)，女，副教授，博士.研究方向：植物病毒学.Email:xueyang27@126.com.