万振洲 姚瑾 胡轶红 张驰宇

225300 泰州市第四人民医院检验科(万振洲)；200031上海，中国科学院上海巴斯德研究所病原诊断中心(姚瑾、胡轶红、张驰宇)

·技术方法·

依赖HIV-1 Tat的毒素蛋白MazF表达系统的建立

万振洲 姚瑾 胡轶红 张驰宇

225300 泰州市第四人民医院检验科(万振洲)；200031上海，中国科学院上海巴斯德研究所病原诊断中心(姚瑾、胡轶红、张驰宇)

目的建立HIV-1 Tat依赖的MazF表达载体pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR系统。方法分别扩增HIV-1 U3TAR和MazF基因片段，通过重叠PCR将U3TAR和MazF连接起来，并TA克隆到pMD18T载体中。通过PCR为MazF引入HA标签，获得U3TAR-MazF-HA。经过双酶切和连接反应，将U3TAR-MazF-HA反向插入到pcDNA3.1，获得pcDNA3.1-HA-MazF-U3TAR。将GFP基因正向插入到MazF基因之后，为该载体引入了荧光报道基因，获得pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR。结果与pcDNA3.1-tat-flag的共转染实验证明，构建的MazF表达载体pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR是Tat依赖的。对比pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR单转染的细胞，共转染的细胞具有更少的绿色荧光信号，表明表达的MazF可以下调报道基因GFP的表达。结论pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR的构建，为探索基于MazF的艾滋病基因治疗方案提供了载体工具。

自1981年首次发现艾滋病以来，全球累计已经感染7 000多万人，其中3 000多万人已死于艾滋病相关的疾病。截至2014年末，全球估计有3 690万人携带艾滋病病毒(HIV)。虽然抗病毒联合疗法(鸡尾酒疗法)在艾滋病的预防控制方面发挥了极大的作用，但是目前依然没有可以有效治愈艾滋病的治疗方案和预防控制艾滋病进一步传播的疫苗[1]。寻找新的治疗艾滋病的策略是该领域的重要课题。

毒素蛋白MazF是从大肠埃希菌中分离出来的一种核糖核酸内切酶，可以特异性地切割mRNA上的ACA序列，破坏mRNA，从而下调或阻止相关蛋白的表达[2-3]。在哺乳动物细胞中过表达的MazF可以优先切割mRNA而不是rRNA[2,4]，提示其可以作为一种毒素蛋白用于肿瘤或者艾滋病的基因治疗。HIV-1是导致全球艾滋病流行的主要病原体，其基因组是2条正链的RNA。不同亚型的HIV-1基因组中包含约240个ACA序列(未发表数据)，这些ACA可以作为MazF的靶点，被MazF切割，从而破坏HIV-1的RNA基因组以及mRNA，抑制病毒的复制。这为MazF用于艾滋病的基因治疗提供理论依据。HIV-1的Tat蛋白是HIV-1 编码的反式转录激活因子(Trans-activator of transcription,Tat)[5]，通过与HIV-1 RNA基因组上的反式激活效应区(Trans-activator responseregion,TAR)相互作用，反式激活HIV-1基因组的转录起始和延伸，增强病毒复制[6-7]。本研究利用Tat和TAR的转录激活元件，构建Tat依赖的MazF真核表达系统，并验证该表达系统的可行性，为下一步构建基于MazF的AIDS基因治疗方案奠定基础。

1 材料与方法

1.1菌种、质粒和细胞pcDNA3.1真核表达载体、DH5a菌株及HEK293T细胞系由中国科学院上海巴斯德研究所病原诊断中心保存。pMDl8T载体购自TaKaRa宝生物工程(大连)公司。质粒pET28a-MazF和pCR2.1-U3TAR由病原诊断中心构建(未发表)。

1.2主要试剂和试剂盒Taq PCR MasterMix和质粒提取试剂盒为TIANGEN公司的产品；胶回收试剂盒、多聚A加尾试剂盒、T4连接酶、T4核苷酸激酶、限制性内切酶、DNA分子量Marker均购自TaKaRa宝生物工程(大连)公司；氨苄抗生素购自Sigma公司；酵母提取物、蛋白胨、琼脂粉为OXOID公司产品；DMEM培养基、胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)、青霉素(10 000 U/ml)、链霉素(10 000I-tg/ml)均购自GIBCO公司。预染蛋白分子量Marker购自mmo公司；硝酸纤维素膜(0.22 prn)为Millipore公司产品；HA标签抗体为Santa Cruz公司产品；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体购自Promega公司。引物由铂尚生物技术(上海)有限公司合成。

1.3U3TAR-MazF片段的扩增依据HIV-1 U3-TAR和大肠埃希菌MazF序列，分别设计扩增U3-TAR和MazF的特异性引物。为了便于将U3-TAR和MazF扩增产物连接起来，并且克隆到pcDNA3.1中，形成依赖U3-TAR启动子(Tat依赖)的MazF表达体系，本研究将U3-TAR的下游引物和MazF的上游引物设计为重叠引物，并在U3-TAR的上游引物和MazF的下游引物的5’端分别添加了EcoRⅠ和HindⅢ的限制性酶切位点。扩增U3-TAR的引物为：U3TAR(F): 5’CCGGAATTCTGGAAGGGCTAATTTAC3’(EcoRⅠ)和U3TAR(R):5’TATCGGCTTACCATTGGGTTCCCTAGTT3’。扩增MazF的引物为mazF(F): 5’AACTAGGGAACCCAATGGTAAGCCGATA-3’和mazF(R): 5’-CCCAAGCTTCTACCCAATCAGTACG-3’(HindⅢ)。分别以质粒pCR2.1-U3TAR和pET28a-MazF为模板，用U3-TAR和MazF引物扩增获得相应的产物，经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收扩增产物。以纯化的U3-TAR和MazF产物为模板，用引物U3TAR(F)和MazF(R)进行重叠PCR扩增。

1.4pMD18-U3TAR-MazF的构建构建10 μl的连接反应体系，将胶回收的U3TAR-MazF产物TA克隆到pMDl8T中，构建pMDl8-U3TAR-MazF。取5 μl连接产物加入到100 μl的DH5α感受态细胞进行转化。铺平板过夜培养，用菌液PCR筛选阳性克隆，扩大培养后，提取质粒。

1.5pcDNA3.1-HA-MazF-U3TAR表达载体的构建为了便于后期表达MazF蛋白的检测，本研究设计一套引物，为MazF添加HA标签。所用引物为：U3TAR-MazF-HA(F):5’-CCGCTCGAGTGGAAGGGCTAATTTACTCCCAAAG-3’(XhoI)，U3TAR-MazF-HA(R)5’-CCGGAATTCCTAAGCATAATCTGGAACATCATATGGATACCCAATCAGTACGTTAA-3’(EcoRⅠ)。为了便于U3TAR-MazF-HA反向插入pcDNA3.1，在U3TAR-MazF-HA的上游和下游的5’-端分别添加了XhoI和EcoRⅠ的限制性酶切位点。以pMD18-U3TAR-MazF为模板，用U3TAR-MazF-HA引物进行PCR扩增获得U3TAR-MazF-HA。反应程序如下：94 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s、46 ℃退火30 S、68 ℃延伸1 min，共5个循环；98 ℃变性10 s、59 ℃退火30 s、68 ℃延伸1 min，共25个循环；68 ℃延伸7 min。电泳鉴定后，胶回收扩增产物。用XhoI和EcoRⅠ分别构建50 μl的U3TAR-MazF-HA和pcDNA3.1的双酶切反应，置37 ℃水浴锅中反应1．5 h。为了防止酶切后的pcDNA3.1自身环化，加入10xSAP buffer 5 μl和SAP 1 μl置37 ℃水浴锅中继续反应30 min。胶回收酶切产物后，构建10 μl连接反应，将pU3TAR-MazF链接到pcDNA3.1中。因为U3TAR-MazF-HA是反向连接到pcDNA3.1中。将构建的质粒命名为pcDNA3.1-HA-MazF-U3TAR。转化、摇菌、菌液PCR验证后，挑选阳性克隆送铂尚生物技术(上海)有限公司测序验证。

1.6pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR的构建设计GFP扩增引物(GFP-F：5’-CCCAAGCTTATGGCCACAACCAA-3’(HindⅢ)，GFP-R：5’-CCCAAGCTTTTACTTAGTACAGCTCG-3’(HindⅢ))。以本实验室保存的PMDl9-GFP为模板扩增GFP基因。电泳鉴定并胶回收扩增产物后，用HindⅢ对GFP胶回收产物和pcDNA3.1-HA-MazF-U3TAR进行单-酶切。胶回收酶切产物后，构建连接反应，将GFP连接到pcDNA3.1-HA-MazF-U3TAR中。转化、摇菌、菌液PCR验证后，挑选阳性克隆送铂尚生物技术(上海)有限公司测序验证，并挑选GFP正向插入的质粒，命名为pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR。

1.7转染实验、Westernblot和荧光显微镜检测将生长状态良好的HEK293T细胞接种于6孔板中，每孔约1.5～2×106个细胞，37 ℃ CO2培养箱中培养24 h，待细胞密度达到50%～60%时进行磷酸钙法转染。转染后，将细胞置于37 ℃ CO2培养箱中培养8 h后，换成新鲜的培养基，继续培养至48 h收样。弃除培养基，用预冷的1 ml 1xPBS洗三次，然后再加入1 ml PBS轻轻地吹落贴壁贴壁细胞，置于1.5 ml离心管中，12 000转/分离心1 min，弃上清，加入总体积为100 μl的2×蛋白上样缓冲液和DTT(2x蛋白上样缓冲液与DTT的体积比为9∶1)混合液重悬细胞，然后100 ℃煮样10 min。选用15%的聚丙烯酰胺凝胶，取10 μl的蛋白预染Marker和15 μl处理的样品进行SDS-PAGE。之后用抗HA抗体进行Western blotting检测MazF的表达。

2 结果

2.1pMD18-U3TAR-MazF的构建分别以实验室保存的质粒pCR2.1-U3TAR和pET28a-MazF为模板，用特异性引物扩增出U3TAR和MazF的基因片段。电泳鉴定显示U3TAR和MazF的扩增产物在336 bp和513 bp处有特异性条带，表明获得了2个基因片段。胶回收2个扩增产物后，以2 个扩增产物为模板，以U3TAR(F)和MazF(R)为引物，进行重叠PCR扩增。因为U3-TAR的下游引物和MazF的上游引物是重叠引物， PCR变性后，U3TAR片段正链是3’端和MazF片段负链的3’端的28个碱基互补配对，互为模板延伸形成U3TAR-MazF。电泳显示在867bp有特异性条带，表明获得U3TAR-MazF产物。胶回收后，将回收产物TA克隆到pMD18中，获得pMD18-U3TAR-MazF。

2.2pcDNA3.1-HA-MazF-U3TAR的构建以pMD18-U3TAR-MazF为模板，用引物U3TAR-MazF-HA(F)和U3TAR-MazF-HA(R)进行PCR扩增。电泳显示在894 bp处有一特异性带，其大小与预期片段一致。胶回收扩增产物后，将其与pcDNA3.1分别用XhoI和EcoRⅠ进行双酶切。去磷酸化后，胶回收U3TAR-MazF-HA和pcDNA3.1片段并进行连接，获得pcDNA3.1-HA-MazF-U3TAR。转化、扩增后，挑阳性克隆测序结果确认U3TAR-MazF-HA片段反向插入到了pcDNA3.1中，表明pcDNA3.1-HA-MazF-U3TAR构建成功。

2.3pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR的构建以pMDl9-T-GFP为模板，用引物GFP(F)和GFP(R)扩增出GFP基因。电泳显示741bp处有特异性条带。胶回收产物后，用HindⅢ对回收产物和pcDNA3．1-U3TAR-MazF-HA(-)进行单酶切。对酶切产物进行胶回收、连接、转化及菌液PCR鉴定出阳性克隆。将阳性克隆送公司测序。测序结果显示GFP为正向插入，从而获得pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR。

2.4pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR与pcDNA3.1-tat-flag的共转染为了验证构建的pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR是否只能在Tat蛋白诱导下才能表达，我们用pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR单独转染HEK293T细胞。因为GFP是正向插入到载体中，转染细胞显示出绿色荧光(图1A和B)。因为无Tat蛋白存在，MazF的表达不能被诱导，Western blot分析没有检测到MazF的特异性条带(图2)。当用pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR与pcDNA3.1-tat-flag共转HEK293T细胞后，荧光显微镜依然可以检测到绿色荧光(图1C和D)，Western blot分析显示，与pcDNA3.1-MazF-HA单转一样，共转染的细胞有MazF的特异性表达(图2)。这表明构建的pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR的MazF表达是Tat蛋白依赖的。此外，相对于pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR单转的细胞，双转染实验中，细胞的状态差，呈现绿色荧光的细胞也明显更少(图1)，这可能是因为高表达的MazF通过特异性切割ACA位点而破坏大量mRNA，杀死细胞，同时因为GFP基因并未经过ACA的改造，其mRNA被MazF降解，从而下调了GFP的表达。

A和C：普通光学显微镜 (40×)；B和D：荧光显微镜(40×)。A: pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR 单转实验的光学显微镜照片，B: pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR 单转实验的荧光显微镜照片C：pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR与pcDNA3.1-tat-flag共转染实验的光学显微镜照片，D: pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR与pcDNA3.1-tat-flag共转染实验的荧光显微镜照片图1 pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR与pcDNA3.1-tat-flag共转染的普通光学和荧光显微镜分析A and C: general optic microscope (40× magnifications);B and D: fluorescence microscope (40× magnifications). A: HEK293T transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR (optics microscope); B: HEK293T transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR (fluorescence microscope); C:HEK293T co-transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR and pcDNA3.1-tat-flag (Optics microscope); D: HEK293T co-transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR and pcDNA3.1-tat-flag (fluorescence microscope)Fig.1 Optics and fluorescent microscope analysis of GFP expression in HEK293T transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR and co-transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR and pcDNA3.1-tat-flag

M： 蛋白相对分子质量Marker,泳道1, 2, 3分别为pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR单转染， pcDNA3.1-mazF-HA单转染和pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR与pcDNA3.1-tat-flag共转染实验, 1∶500稀释的鼠抗HA单抗用于MazF表达的检测。图2 Western blot检测pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR与pcDNA3.1-tat-flag共转染实验中MazF的表达M：Protein Marker(DL2000)，Lanes 1, 2 and 3: HEK293T transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR, pcDNA3.1-mazF-HA and co-transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR and pcDNA3.1-tat-flag, respectively. Mouse anti-HA mAb (1∶500) was used to detect the HA-labeled MazF.Fig.2 Western blot detection of MazF expression in HEK293T transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR and co-transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR and pcDNA3.1-tat-flag

3 讨论

HIV-1是高度变异的病毒，其高变异性使病毒更易产生耐药突变，也增加了AIDS疫苗研发的难度[8]。随着miRNA的发现以及基因组编辑技术的出现，艾滋病的基因治疗成为新的发展方向[9]。AIDS基因治疗的靶标可以针对HIV-1病毒本身(如针对HIV-1 RNA基因组的miRNA)[10]、抑制病毒复制，或者针对与病毒感染相关的宿主基因(如HIV-1感染所需的辅助受体CCR5或者CXCR4)进行基因组编辑，从而敲除这些基因[11-14]。另外一种艾滋病基因治疗的思路是，通过载体将毒素蛋白基因(自杀基因)导入到细胞，利用毒素蛋白，杀死HIV-1感染的细胞。

MazF是大肠埃希菌中发现的一种毒素蛋白，其可以特异性地识别和切割mRNA上的ACA位点，降解mRNA，阻止相关蛋白的合成，导致细胞死亡[2]。本研究对各个HIV-1亚型基因组序列分析发现，不论何种HIV-1亚型，其基因组中都包含有约240个左右的ACA位点(未发表的数据)。HIV-1的基因组是正链RNA，可以直接作为mRNA，启动病毒早期基因的表达翻译。 因此，MazF是一种可以用于艾滋病基因治疗的候选自杀基因。因为MazF对ACA的识别和切割是无选择性的，一旦MazF基因导入到细胞中，将杀死细胞。因此，如何设计和构建一种MazF表达载体，使其可以特异性地杀死HIV-1感染细胞，将是建立基于MazF的艾滋病基因治疗方案的关键。

Tat是HIV-1编码的转录反式激活因子，在HIV-1的转录过程中起十分重要的调节作用[5]。在没有Tat的情况下,HIV-1的转录和复制维持在非常低的水平。当Tat存在时，可以通过与TAR RNA相互作用激活转录,将HIV-1的转录效率提高几百倍[6-7]。为了构建可以特异性杀伤HIV-1感染细胞的MazF表达载体，本研究将HIV-1的转录启动子U3TAR与MazF基因连接到一起，并且反向插入到pcDNA3.1表达载体中，构建了pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR。HIV-1启动子U3TAR是Tat蛋白依赖的启动子，其与MazF基因一起被反向插入到pcDNA3.1表达载体中，在正常细胞中，因为缺乏Tat蛋白，不能启动MazF的表达，不会杀伤正常细胞。当pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR被导入到HIV-1感染细胞，感染细胞中表达的Tat蛋白将与U3TAR结合，激活MazF的表达，表达的MazF杀死感染细胞。为了防止表达的MazF对自身mRNA的切割，本研究通过氨基酸同义替代的规则，将MazF基因中的ACA位点进行了同义替换，即保证了MazF蛋白质一级结构的一致，又避免了MazF下调自身的表达。

本研究证明，通过pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR与pcDNA3.1-tat-flag的共转染实验，构建的MazF表达载体pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR是Tat依赖性的，只有在Tat存在时，才可以表达MazF。此外，共转染的细胞比pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR单转染的细胞具有更少的绿色荧光信号，表明表达的MazF可以明显下调报道基因GFP的表达。pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR的构建，为探索基于MazF的艾滋病基因治疗方案提供了载体工具。

[1] Hull MW, Montaner J. Antiretroviral therapy: a key component of a comprehensive HIV prevention strategy[J]. Curr HIV/AIDS Rep, 2011, 8(2): 85-93. doi: 10.1007/s11904-11011-10076-11906.

[2] Zhang Y, Zhang J, Hoeflich KP, et al. MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli[J]. Mol Cell, 2003, 12(4): 913-923.

[3] Yamaguchi Y, Nariya H, Park JH, et al. Inhibition of specific gene expressions by protein-mediated mRNA interference[J]. Nat Commun, 2012, 3: 607. doi: 610.1038/ncomms1621.

[4] Christensen-Dalsgaard M, Gerdes K. Translation affects YoeB and MazF messenger RNA interferase activities by different mechanisms[J]. Nucl Acids Res, 2008, 36(20): 6472-6481. doi: 6410.1093/nar/gkn6667.

[5] Garcia JA, Harrich D, Soultanakis E, et al. Human immunodeficiency virus type 1 LTR TATA and TAR region sequences required for transcriptional regulation[J]. EMBO J, 1989, 8(3): 765-778.

[6] Berkhout B, Silverman RH, Jeang KT. Tat trans-activates the human immunodeficiency virus through a nascent RNA target[J]. Cell, 1989, 59(2): 273-282.

[7] Rana TM, Jeang KT. Biochemical and functional interactions between HIV-1 Tat protein and TAR RNA[J]. Arch Biochem Biophys, 1999, 365(2): 175-185. doi: 110.1006/abbi.1999.1206.

[8] Pham QD, Wilson DP, Law MG, et al. Global burden of transmitted HIV drug resistance and HIV-exposure categories: a systematic review and meta-analysis[J]. AIDS, 2014, 28(18): 2751-2762. doi: 2710.1097/QAD.0000000000000494.

[9] de Mendoza C, Barreiro P, Benitez L, et al. Gene therapy for HIV infection[J]. Expert Opin Biol Ther, 2015, 15(3): 319-327. doi: 310.1517/14712598.14712015.14967208.

[10] Swaminathan G, Navas-Martin S, Martin-Garcia J. MicroRNAs and HIV-1 infection: antiviral activities and beyond[J]. J Mol Biol, 2014, 426(6): 1178-1197. doi: 1110.1016/j.jmb.2013.1112.1017.

[11] Cornu TI, Mussolino C, Bloom K, et al. Editing CCR5: a novel approach to HIV gene therapy[J]. Adv Exp Med Biol, 2015, 848: 117-130. doi: 110.1007/1978-1001-4939-2432-1005_1006.

[12] Drake MJ, Bates P. Application of gene-editing technologies to HIV-1[J]. Curr Opin HIV AIDS, 2015, 10(2): 123-127. doi: 110.1097/COH.0000000000000139.

[13] Gu WG. Genome editing-based HIV therapies[J]. Trends Biotechnol, 2015, 33(3): 172-179. doi: 110.1016/j.tibtech.2014.1012.1006.

[14] Saayman S, Ali SA, Morris KV, et al. The therapeutic application of CRISPR/Cas9 technologies for HIV[J]. Expert Opin Biol Ther, 2015, 15(6): 819-830. doi: 810.1517/14712598.14712015.11036736.

ConstructionofanHIV-1Tat-dependentMazFexpressionvector

WanZhenzhou,YaoJin,HuYihong,ZhangChiyu

MedicalLaboratoryofTaizhouFourthPeople’sHospital,Taizhou225300,China(WanZZ);PathogenDiagnosticCenter,InstitutePasteurofShanghai,ChineseAcademyofScience,Shanghai200031,China(YaoJ,HuYH,ZhangCY)

ZhangChiyu,Email:zhangcy1999@ips.ac.cn

ObjectiveTo construct a Tat-dependent MazF expression vector pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR.MethodsHIV-1 U3TAR and MazF gene were amplified from pCR2.1-U3TAR and pET28a-MazF, respectively. Two gene fragments were linked together to form U3TAR-MazF by an overlapping PCR, and then cloned into pMD18T. An N-terminal HA tag was added to MazF to form U3TAR-MazF-HA. After double enzyme digestion usingEcoR I andHindⅢ, U3TAR-MazF-HA was reversely inserted into pcDNA 3.1 to form pcDNA3.1-HA-MazF-U3TAR. Then, a fluorescent reporter gene GFP was inserted into the downstream of U3TAR to form pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR.ResultsThe co-transfection experiments with pcDNA3.1-tat-flag showed that pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR is Tat dependent. MazF was expressed only under the presence of Tat. In addition, compared with the cells transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR, less green fluorescent signal was observed in the cells co-transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR and pcDNA3.1-tat-flag, indicating that expressed MazF down-regulated the expression of GFP.ConclusionsThe expression vector pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR will provide an important tool for the development of MazF-based AIDS gene therapy strategies.

AIDS; Tat; Toxin protein MazF; Gene therapy

艾滋病；Tat；毒素蛋白MazF；基因治疗

2016-03-07)

(本文编辑：唐浏英)

张驰宇，Email:zhangcy1999@ips.ac.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.04.019