李晓峰 林霞 陈惠芹 蔡耘 张萍萍 陈壮桂

510630 广州， 中山大学附属第三医院儿科(李晓峰、陈惠芹、蔡耘、张萍萍、陈壮桂)；妇产科(林霞)

·论著·

婴儿巨细胞病毒性肝炎患儿体内一氧化氮和内皮型一氧化氮合酶水平的研究

李晓峰 林霞 陈惠芹 蔡耘 张萍萍 陈壮桂

510630 广州， 中山大学附属第三医院儿科(李晓峰、陈惠芹、蔡耘、张萍萍、陈壮桂)；妇产科(林霞)

目的探讨婴儿巨细胞病毒性肝炎(ICH)患者体内一氧化氮(NO)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的水平及其临床意义。方法ELISA方法检测56例ICH患儿和50例健康对照组血清NO和eNOS的水平，统计学方法分析其与患儿肝功能、人巨细胞病毒(HCMV)DNA拷贝数的关联。结果ICH组NO和eNOS的水平显著高于健康对照组(P<0.01)。ICH组中ALT异常组NO和eNOS水平显著高于ALT正常组(P<0.05)。ICH组中NO和eNOS的水平与ALT呈明显正相关(r=0.682，r=0.746，P<0.05)，但与HCMV-DNA拷贝数无显著相关性(r=-0.087，r=-0.134，P>0.05)。结论ICH患儿体内NO以及eNOS水平显著升高，与患儿肝脏功能损伤呈正相关。

一氧化氮(NO)是一种普遍在于各种细胞中的具有多种活性的生物介质，内皮型一氧化氮合酶(eNOS)是内皮细胞合成NO的主要合成酶。研究表明，NO与eNOS在病毒性肝炎发生和发展过程中具有保护性作用进，但上述结果多在成人乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)等病毒感染患者体内研究的结果。目前对NO和eNOS水平在婴儿期最常见的婴儿巨细胞病毒性肝炎(Infantile cytomegalovirus hepatitis，ICH)中的水平及与肝功能的关联研究迄今未见报道。本研究通过检测ICH患儿血清NO和eNOS的表达水平及与HCMV-DNA定量和肝脏炎症程度的相关性研究，来探讨其在HCMV病变进展过程中的作用。

1 对象与方法

1.1研究对象ICH组患者为2012年2月—2016年2月在中山大学附属第三医院住院的首诊ICH患儿，根据巨细胞病毒感染诊断方案[1-3]，确诊为HCMV感染性肝炎(检测血清CMVpp65阳性或CMV-IgM阳性，HCMV-DNA定量>103拷贝/ml)，排除其他病原体感染、药物中毒性肝炎、胆道系统畸形以及遗传代谢性疾病。ICH组共入组56例，其中男性32例，女性24例，平均年龄(3.54±2.72)月。健康对照组为同期儿童保健门诊婴儿，血清检测CMVpp65和CMV-IgM均阴性，共入组50例，男性28例，女性22例，平均年龄(3.25±2.36)月。ICH组与对照组在年龄与性别构成上无显著性差异。所有研究对象家属均签署知情同意书。

1.2研究方法抽取清晨空腹静脉血5 ml，分离血清，测定肝功能指标，包括丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase, ALT)天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase, AST)、胆红素(Bilirubin，BIL)、白蛋白和球蛋白，用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)法定量分析HCMV-DNA拷贝数(人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司)。使用ELISA方法测定NO和eNOS的浓度(人血清一氧化氮(NO)检测ELISA试剂盒、人内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)(Elisa)酶联免疫试剂盒均购自上海江莱生物科技有限公司)。

2 结果

2.1ICH组与对照组的临床资料分析ICH组的AST、ALT、γ-GT、TBA、TBIL、DBIL显著高于对照组(P<0.05)，56例ICH组患儿中ALT正常者23例，ALT异常者33例；而两组间的年龄及性别构成差异无统计学意义(表1)。

表1 ICH组与对照组的临床资料分析

注：与对照组相比，aP<0.05，bP<0.01

Note:aP<0.05,bP<0.01 compared with Control group

2.2NO和eNOS的检测结果ICH组NO和eNOS水平分别为83.37±25.19 μmol/L和17.21±6.03 IU/ml，均显著高于对照组的48.62±16.46 μmol/L和8.61±4.03 IU/ml(P<0.01)(表2)。

表2 ICH组与对照组间NO和eNOS的比较

2.3ICH患儿ALT异常组与ALT正常组比较结果 ALT异常组相较于ALT正常组NO和eNOS水平均显著升高(P<0.05)，而两组间HCMV-DNA定量中位数差异无统计学意义(P=0.253)(表3)。

表3 ALT异常组与ALT正常组间的比较

图1 NO水平与ALT的相关性Fig.1 Correlation between levels of NO and ALT

图2 eNOS水平与ALT的相关性Fig.2 Correlation between levels of eNOS and ALIT

2.4NO和eNOS水平与ALT及HCMV-DNA定量的相关性在ICH组患儿中，NO和eNOS的水平与ALT呈明显正相关关系(r=0.682，r=0.746，P<0.05)(图表1、2)，而与HCMV-DNA定量之间无明显相关关系。(r=-0.087，r=-0.134，P>0.05)。

3 讨论

内皮细胞中由eNOS催化生成的NO是一种强内皮细胞舒血管因子，也是细胞间信息传递和调节的重要生物介质。大量国内外研究表明，HBV、HCV、HEV等病毒性肝炎患者体内eNOS基因转录水平增强，大量生成eNOS，NO合成系统被激活，导致NO和eNOS的水平均明显升高。NO表达水平的增高，进一步激活鸟苷酸环化酶从而导致cGMP水平增高，在肝脏可发挥扩张小血管、改善微循环、减低肝细胞有氧代谢，抑制枯否细胞对肝组织的炎症损伤，从而发挥肝脏保护性作用[4-6]。本研究结果显示，ICH患儿体内NO和eNOS的水平较健康对照组均是显著升高，与成人慢性病毒型感染患者体内的研究结果相似，提示NO产生系统的活化也可作为一种保护机制，在HCMV感染肝脏组织后，通过相应的病理生理过程，缓解感染后免疫炎症对肝脏损伤。

既往研究表明，慢性乙肝患者体内eNOS的表达水平与肝脏组织炎症程度相关[7]。本研究结果发现ALT异常的ICH患儿体内的NO和eNOS水平明显高于ALT正常的ICH患儿，且NO和eNOS的浓度与ALT水平呈明显正相关，提示ICH患儿体内NO以及eNOS的水平与与ICH的病变严重程度密切关联。eNOS在肝脏主要存在于肝细胞、窦内皮细胞以及血管内皮细胞胞质内，当病毒通过激活免疫系统严重损伤肝组织时，体内大量eNOS释放，进而导致NO水平的升高[8,9]，因此起到保护肝脏的作用，而肝脏损伤程度较轻的患者体内NO的生成也会较正常对照组有所升高。

本研究未发现NO和eNOS的水平与HCMV-DNA之间的关联，提示ICH患儿体内的NO系统的活化可能与体内HCMV的复制无关，而与病毒感染后引起的免疫损伤有关。由于本研究纳入的病例数量相对较少，上述关于NO和eNOS水平与HCMV复制之间的关联分析可能存在系统误差，需要进一步扩大样本量深入分析。

综上，ICH患儿体内NO以及eNOS水平升高及与肝脏炎症程度加重的关联结果与成人嗜肝病毒感染研究结果相近，表明由eNOS催生的NO对于HCMV感染的肝脏炎症起到保护性作用。但是NO系统在病毒性肝炎中的具体作用机制还有待进一步深入研究。

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RoleofNitricoxideandendothelialnitricoxidesynthaseininfantswithcytomegalovirushepatitis

LiXiaofeng,LinXia,ChenHuiqin,CaiYun,ZhangPingping,ChenZhuanggui.

DepartmentofPediatrics(LiXF,ChenHQ,CaiY,ZhangPP,ChenZG),DepartmentofObstetrics(LinX)theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China

ChenZhuanggui,Email:chenzhuanggui@126.com

ObjectiveTo investigate the potential clinical role of nitric oxide (NO) and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in infants suffering from infantile cytomegalovirus hepatitis (ICH).MethodsNO and eNOS were measured in 56 ICH infants and 50 healthy controls by using ELISAmethod .ResultsNO and eNOS were significantly increased in ICH group as compared with the controls (P<0.01) accompanied by increased ALT in infants of ICH group (P<0.05). Both of NO and eNOS levels were significantly positively correlated with the level of ALT(r=0.682,r=0.746,P<0.05). However, neither NO level nor eNOS level was significantly correlated with the number of copies of HCMV-DNA (r=-0.087,r=-0.134,P>0.05).ConclusionsThe expressions of NO and eNOS were significantly increased in infants with human cytomegalovirus hepatitis, and were closely related to the severity of liver lesion.

Cytomegalovirus; Hepacivirs; Nitric oxide; Endothelial nitric oxide synthase; Child, hospitalized

巨细胞病毒；肝炎病毒；一氧化氮；内皮型一氧化氮合酶；儿童，住院

2017-04-20)

(本文编辑：陈培莉)

陈壮桂，Email: chenzhuanggui@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.04.004

国家自然科学基金面上项目(81470219)；广东省科技计划项目基金(2014A020212120)

Fundprograms: National Natural Science Foundation of China (81470219)；Science and Technology Planning Project of Guangdong Province, China (2014A020212120)