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乳香没药挥发油对川芎中阿魏酸促透机制的研究

2017-09-23管咏梅陶玲朱小芳臧振中金晨陈丽华

中国中药杂志 2017年17期

管咏梅 陶玲 朱小芳 臧振中 金晨 陈丽华

[摘要] 该研究拟探索乳香没药挥发油对川芎的促透机制,观察乳香没药挥发油对角质层微观及分子结构的影响。通过测定川芎中阿魏酸在乳香没药挥发油作用下的角质层/介质分配系数,采用扫描电镜观察乳香、没药挥发油对皮肤角质层结构的影响,利用傅里叶变换红外光谱仪考察乳香、没药挥发油对角质层内角蛋白和脂质的分子结构的影响,来探索乳香没药挥发油对角质层微观及分子结构的影响。研究结果显示乳香、没药挥发油可使阿魏酸在角质层与介质分配增强,使角質层有规律的,整齐紧密堆积排列的叠瓦式结构受到一定程度的破损,同时有部分表皮鳞片向上翻起,出现局部脱落现象。另乳香、没药挥发油使角质层脂质的CH2伸缩振动峰和角质层角蛋白的酰胺伸缩振动峰均发生了相对的位移,表明,乳香、没药挥发油可能是使角质层中脂质及角蛋白的构象发生改变,增加角质层脂质双分子层的流动性,改变有序致密结构,来达到使皮肤的通透性增加,屏障作用降低的效果。由此可知,乳香没药可能通过增加药物在角质层分配,改变皮肤角质层结构来达到促渗效果。

[关键词] 乳香没药挥发油; 中药挥发油; 经皮给药; 促透机制; 角质层微观结构

Effects of Frankincense and Myrrh essential oil on transdermal

absorption of ferulic acid in Chuanxiong

GUAN Yongmei1,2, TAO Ling1, ZHU Xiaofang1, ZANG Zhenzhong1, JIN Chen1*, CHEN Lihua1

(1.Key Laboratory of Modern Preparation of Traditional Chinese Medicine under Ministry of Education, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China;

2. Jiangxi Province Research Center of Extracts and Preparations Engineering Technology of

Traditional Chinese Medicine, Yichun 336000, China)

[Abstract] The aim of this paper was to explore the effects of Frankincense and Myrrh essential oil on transdermal absorption, and investigate the mechanism of permeation on the microstructure and molecular structure of stratum corneum. Through the determination of stratum corneum/medium partition coefficient of ferulicacid in Chuanxiong influenced by Frankincense and Myrrh essential oil, the effects of volatile oil of frankincense and Myrrh on the the microscopic and molecular structure of stratum corneum were explored by observation of skin stratum corneum structure under scanning electron microscopy, and investigation of frankincense and myrrh essential oil effects on the molecular structure of keratin and lipids in stratum corneum under Fourier transform infrared spectroscopy. The results showed that the oil could enhance the distribution of ferulic acid in the stratum corneum and medium, and to a certain extent damaged the imbricate structure of stratum corneum which was originally regularly, neatly, and closely arranged; some epidermal scales turned upward, with local peeling phenomenon. In addition, frankincense and myrrh essential oil caused the relative displacement of CH2 stretching vibration peak of stratum corneum lipids and amide stretching vibration peak of stratum corneum keratin, indicating that frankincense and myrrh essential oil may change the conformation of lipid and keratin in the stratum corneum, increase the bilayer liquidity of the stratum corneum lipid, and change the orderly and compact structure to increase the skin permeability and reduce the effect of barrier function. It can be concluded that Frankincense and Myrrh essential oil can promote the permeation effect by increasing the distribution of drugs in the stratum corneum and changing the structure of the stratum corneum.endprint

[Key words] Frankincense and Myrrh essential oil; traditional Chinese medicine essential oil; transdermal delivery system; penetration mechanism; stratum corneum microstructure

经皮给药是常用给药途徑之一,具有给药方便、可避免首关效应、长时间维持恒定血药浓度等用药优势,基于这些优势,经皮给药拥有巨大的应用前景。但皮肤的屏障作用,尤其是皮肤角质层阻止了大多药物渗透进入皮肤组织,限制药物的经皮吸收,影响药物生物利用度,故药物的促渗研究成为当前研究热点[13]。中药挥发油大多具有良好的透皮吸收促进效果[45],课题组[6]通过体外渗透动力学曲线及相关经皮渗透参数发现,乳香、没药挥发油配伍前后对川芎指标成分阿魏酸均具有一定的促渗透作用,且混合提取所得的挥发油促渗作用最强,单提混合所得挥发油促进作用倍数小于两者单用,因此研究乳香、没药挥发油对川芎的促透作用及其机制或可阐述其配伍意义,对于中药挥发油在经皮给药的应用研究也至关重要。本研究拟采用扫描电镜直观观察乳香、没药挥发油对皮肤角质层结构的影响,同时利用傅里叶变换红外光谱技术考察乳香、没药挥发油对角质层内角蛋白和脂质的分子结构的影响,期望阐述乳香没药挥发油对皮肤角质层作用的促透机制。

1 材料

QYC200恒温摇床(上海福玛实验设备有限公司);SIGMA318K高速冷冻离心机(德国SIGMA公司);DN24A干式氮吹仪(上海比郎仪器有限公司);Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);KQ3200E型超声波清洗器(45 kHz,240 W,昆明市超声仪器有限公司);ESJ1824型电子分析天平(1/10万,沈阳龙腾电子有限公司);XW80A涡旋混合器(上海青浦沪西); Quanta 250型扫描电子显微镜(美国FEI公司);K750X型冷冻干燥仪(英国Quorum公司);specturm two型衰减全反射傅利叶变换红外光谱仪(美国Perkin Elmer公司)。

乳香饮片(批号150914,产地云南)、没药饮片(批号151227,产地云南) 、川芎饮片(批号150805,产地四川),均购自江西樟树药材市场,江西中医药大学中药鉴定教研室邓可众教授鉴定为正品;乳香、没药挥发油采用 2015 年版《中国药典》附录挥发油提取甲法提取,得淡黄油状溶液,无水硫酸钠脱水后密封避光保存;氮酮(纯度97%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司,批号140618);阿魏酸对照品(纯度>98%,成都普菲德生物技术有限公司,批号151103);1,2丙二醇(西陇化工股份有限公司,批号151123);胰蛋白酶(牛胰,上海瑞永生物科技有限公司);戊二醛(纯度25%,天津市光复精细化工研究所,批号150316);锇酸(纯度2%,兰州中科凯特科工贸有限公司);冰醋酸(西陇科学股份有限公司,批号160517);甲醇(色谱纯,美国Tedia公司);乙腈(色谱纯,美国Tedia公司);水为纯净水,其他试剂均为分析纯。

SPF级,健康KM小鼠,雄性,体质量(20±2) g,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,动物许可证编号SCXK(湘)20130004。

2 方法

2.1 乳香没药挥发油对川芎向角质层分配的影响

2.1.1 离体小鼠皮肤角质层的制备 取健康雄性小鼠,眼用弯剪剪去其腹部毛发,脱颈椎处死,用剪刀剥取其腹部无毛皮肤,并小心去除皮下脂肪及黏液组织,用生理盐水漂洗至无浑浊,清洗干净。室温下,将制得的小鼠腹皮置于胰蛋白酶溶液(0.4%)中处理10 h,接着用棉签小心分离皮肤角质层,制备的皮肤角质层用纯水清洗干净,备用。

2.1.2 川芎中阿魏酸角质层/介质分配系数的测定 取干燥小鼠皮肤角质层,剪刀剪碎,称取约10 mg置于匀浆器中,加入生理盐水并匀浆,再将匀浆液于氮气下吹干,加入1 mL相应浓度促透剂的含药溶液复溶,实验分别设置溶剂组(丙二醇水溶剂系统[78])、乳香没药挥发油组及氮酮组(各组浓度选择同体外透皮实验),超声30 min,涡旋混匀,置于37 ℃恒温水浴平衡12 h,再于离心机1万 r·min-1,离心10 min,离心后取上清液适当稀释,按照建立的液相方法进样,测定药物含量,每组平行操作3次。

2.2 扫描电镜直观观察乳香、没药挥发油对皮肤角质层结构的影响[9]

2.2.1 角质层分组与给药 将2.1.1项下制备好的角质层分为4 cm2大小的7小样分别放入7个具塞西林瓶中,空白组(空瓶),溶剂组(1,2丙二醇蒸馏水8∶2),阳性对照组(3%氮酮),实验组(3%乳香挥发油,3%没药挥发油,3%乳香没药单提混挥发油,3%乳香没药混提挥发油,各浓度设置同体外透皮实验),其中阳性对照组和实验组处理溶液均用1,2丙二醇蒸馏水8∶2溶剂系统配制。向西林小瓶中分别加入相应的实验处理溶液10 mL,在室温下密封处理12 h。处理完毕后,先用pH 7.0的磷酸缓冲盐冲洗3遍,再用生理盐水清洗干净,备用。

2.2.2 扫描电镜样品制备 ①初固定:给药完毕后,取得的角质层用无水乙醇冲洗6次,每次冲洗30 s,以洗净角质层表面残留的药液,用滤纸吸干其表面残留的溶液。将处理好及未处理的皮肤角质层(共7块)固定于2.5%戊二醛溶液中,常温避光固定4 h。②漂洗:将固定好的皮肤角质层样品在0.1 mol·L-1的磷酸缓冲液漂3次,每次漂洗15 min,(为充分清洗掉皮肤上残留的醛,清洗时可在烧杯中震荡)。③后固定:将漂洗后的角质层样品放置于1%锇酸中进行再固定,常温避光固定2 h。④再漂洗:将后固定好的角质层样品放置在0.1 mol·L-1的磷酸缓冲液漂洗3次,每次漂洗15 min,再用滤纸吸干其表面残留的清洗液。⑤真空冷冻干燥法干燥:即温度梯度干燥,以0.05 ℃的速率升温,-20 ℃,8 h;-10 ℃,6 h;0 ℃,6 h;10 ℃,6 h;15 ℃,5 h。⑥离子溅射喷金:利用离子溅射仪将干燥后的皮肤样品在表面溅射一层金属粒子,形成薄薄的金属膜。⑦扫描电镜对各组皮肤进行拍照,观察各组皮肤表面的形态学变化(1 600倍)。endprint

2.3 傅里叶变换红外光谱技术考察乳香、没药挥发油对角质层内角蛋白和脂质的分子结构的影响

2.3.1 傅利叶变换红外光谱条件 室温20~25 ℃,相对湿度45%,反射棱镜(ZnSe),入射角 45°,扫描次数64次,分辨率4 cm-1,扫描范围4 000~400 cm-1。

2.3.2 傅利叶变换红外光谱样品制备与检测 将2.1.1项下制备好的角质层分为4 cm2大小的7小样分别放入7个具塞西林瓶中,空白组(空瓶),溶剂组(1,2丙二醇蒸馏水80∶20),阳性对照组(3%氮酮),实验组(3%乳香挥发油;3%没药挥发油;3%乳香没药单提混挥发油;3%乳香没药混提挥发油,各浓度设置同体外透皮实验),其中阳性对照组和实验组处理溶液均用1,2丙二醇蒸馏水80∶20溶剂系统配制。向西林小瓶中分别加入相应的实验处理溶液10 mL,在室温下密封处理12 h。处理完毕后,先用pH 7.0的磷酸缓冲盐冲洗3遍,再用生理盐水清洗干净,放置真空干燥箱中37 ℃脱水干燥。将制备好的各组角质层样品采用ATRFTIR光谱仪进行扫描。

3 结果

3.1 川芎中阿魏酸角质层/介质分配系数的测定结果

药物在角质层与介质的分配系数K=C角质层药物/C上清液药物,得川芎中阿魏酸在不同促透剂作用条件下,其在角质层与介质中的分配系数,见表 1,其中在氮酮作用下,川芎中阿魏酸角质层/介质分配系数显著性增加,与溶剂组比较,其在角质层与介质分配增强倍数可达到2.72。乳香、没药挥发油表现出类似氮酮的增加川芎中阿魏酸角质层/介质分配系数的作用,但作用的强度较弱于氮酮,其使川芎中阿魏酸在角质层与介质分配增强倍数分别可达到2.31,2.15。

3.2 掃描电镜结果

正常小鼠皮肤角质层表面平坦、光滑,有少量的分泌物附着,并且角质层细胞呈叠瓦式结构有规律地,整齐紧密地堆积排列,见图1,而这种结构可能正是使皮肤具备良好渗透性屏障的原因之一。不同促透剂作用于小鼠皮肤后,其对皮肤角质层微观形态学的变化见图2。与正常皮肤比较,A组(溶剂)皮肤角质层仍呈叠瓦式结构有规律地,整齐紧密地堆积排列,但是表面出现一定的褶皱,这可能是溶剂1,2丙二醇的作用。与溶剂组皮肤比较,B组(氮酮)皮肤角质层有规律的,整齐紧密堆积排列的叠瓦式结构有一定程度的松动,形成了部分小小的间裂隙,而且其表面的褶皱明显增多加深。然而,C~F(不同条件的挥发油)4组的皮肤角质层与溶剂组的比较,角质层有规律的,整齐紧密堆积排列的叠瓦式结构受到一定程度的破损,同时有部分表皮鳞片向上翻起,角质层出现局部脱落现象。因此,4组挥发油对皮肤角质层微观形态学变化的作用类似,但作用强度稍大于氮酮。

3.3 乳香、没药挥发油对角质层内角蛋白和脂质的分子结构的影响的结果

空白组角质层结构的脂质OH特征振动吸收为3 283.65 cm-1,C=O特征振动吸收为1 741.78 cm-1,CH2特征不对称振动吸收为2 917.81 cm-1,CH2特征对称振动吸收为2 850.25 cm-1,酰胺Ⅰ特征振动吸收为1 645.80 cm-1,酰胺Ⅱ特征振动吸收为1 538.82 cm-1,见表2,3。溶剂对照组的各个特征振动吸收峰与空白组的比较无统计学差异,明确所选溶剂系统不会对皮肤角质层产生影响。氮酮阳性对照组的各个特征振动吸收峰与空白组的比较,其中CH2不对称振动吸收峰波数(2 922.85 cm-1)和CH2对称振动吸收峰波数(2 853.23 cm-1)发生3 cm-1以上波数的相对位移,其他特征振动吸收峰的波数位移无明显变化,表明氮酮可能通过改变角质层脂质结构的构象来扰乱其致密有序排列的结构。给药组(乳香挥发油,没药挥发油,乳香+没药挥发油,乳没药对挥发油)处理的角质层结构的脂质各个特征振动吸收峰与空白组的比较,其中CH2不对称振动吸收峰波数(2 923 cm-1左右)和CH2对称振动吸收峰波数(2 853 cm-1左右)位移都发生了3 cm-1以上相对的蓝移,而且皮肤角质层中角蛋白的酰胺振动Ⅰ峰波数(1 645 cm-1左右)发生相对的红移,有的还出现了裂缝,酰胺振动Ⅱ峰波数(1 538 cm-1左右)未发生相对的位移,而且有乳香挥发油处理过的皮肤角质层脂质的OH特征吸收峰波数发生了4 cm-1左右相对的红移,见图3。上述结果表明,乳香、没药挥发油可能是通过改变皮肤角质层脂质、角蛋白结构的构象,扰乱其致密有序性,改善脂质的流动性,来发挥促药经皮吸收的效果,并且乳香挥发油还可能通过水合作用来实现促药渗透。

4 讨论

近年来,中药挥发油作为经皮给药促透剂的研究已成热点[1011],促透机制的研究已成趋势。扰乱高度有序排列的皮肤角质层结构是目前普遍认为的经皮促透剂促渗机制[12]。本文通过测定川芎中阿魏酸角质层/介质分配系数,发现乳香没药挥发油可增加川芎中阿魏酸角质层/介质分配系数的作用,且药对组使川芎中阿魏酸在角质层与介质分配增强倍数可达到2.83,其作用较优于乳香(2.31)和没药(2.15)挥发油组,同时可见乳没单提混合组呈现出的作用并不是乳香与没药挥发油简单应用的加和,但是,乳没单提混合组(3.81)大于药对组(2.83)作用与课题组前期实验结论矛盾,出现这种差异性的原因还有待进一步的实验研究。采用扫描电镜(SEM)拍照观察氮酮,乳香、没药挥发油处理过的小鼠皮肤角质层结构的变化,发现氮酮可使皮肤角质层整齐紧密堆积排列的叠瓦式结构有一定程度的松动,形成了部分小小的间裂隙,而且其表面的褶皱明显增多加深,而乳香、没药挥发油可使叠瓦式结构受到一定程度的破损,同时有部分表皮鳞片向上翻起,角质层出现局部脱落现象,故猜测乳香没药对皮肤角质层作用与氮酮类似,主要通过破坏角质层结构,增加皮肤通透性,降低药物扩善阻力,来达到促渗目的,且作用更强,这也在一定程度上佐证了乳香没药的在临床应用中对皮肤刺激的不良反应[13],需严格控制剂量以保证用药安全性。此外,在扫描电镜直观观察乳香、没药挥发油对皮肤角质层结构的影响时对角质层样品的漂洗文献报道多用0.1 mol·L-1的磷酸缓冲液,样品前处理未见报道,课题组在前期测定川芎中的阿魏酸在不同pH磷酸盐缓冲液中的平衡溶解度的实验中,发现pH 6.8可能是3种促透剂发挥经皮促透作用的较理想的皮肤生理pH,考虑到对皮肤pH的影响,故选用pH 7.0的磷酸缓冲盐冲洗,而非常用0.1 mol·L-1的磷酸缓冲液(pH 7.3),至于pH对试验结果的具体影响需进一步探索。endprint

本文另采用傅利叶变换红外光谱测定氮酮,乳香、没药挥发油处理过的皮肤角质层脂质及角蛋白的结构或构象,拟从分子水平来阐述氮酮,乳香、没药挥发油对角质层作用的机制,发现氮酮使皮肤角质层脂质的CH2伸缩振动峰发生了位移,角质层角蛋白的酰胺伸缩振动峰未发生变化,表明氮酮可能是通过改变角质层中脂质的构象来扰乱其致密有序排列的结构,然而,乳香、没药挥发油使角质层脂质的CH2伸缩振动峰和角质层角蛋白的酰胺伸缩振动峰均发生了相对的位移,表明,乳香、没药挥发油可能是使角质层中脂质及角蛋白的构象发生改变,增加角质层脂质双分子层的流动性,改变有序致密结构,来达到使皮肤的通透性增加,屏障作用降低的效果。然而角质层脂质是一个完整的分子结构,包括分子非极性头区和分子极性头区,傅利叶变换红外光谱技术只可检测到脂质非极性链的分子改变,分子极性头区的分子构象改变难以检测。因此,乳香、没药挥发油是如何改变角质层脂质整个分子的结构也需进一步的实验研究。

乳香、没药在我国具有悠久的药用历史,但配伍机制的阐明及其新制剂技术的开发目前尚处于起步阶段,而对乳香没药挥发油的促渗机制研究不仅可促进乳香没药配伍机制的研究,更可促进中药挥发油在经皮给药中的应用,上述结果只是从皮肤角质层最表层的结构来阐述乳香、没药挥发油促透作用的机制,而乳香、没药挥发油是如何改变皮肤角质层有序致密的结构,还需进一步的实验研究,至于与报道的相关作用机制如拉动效应[14]、增强皮肤角质层的水合作用[15]、增加皮肤血流等的联系也需要进一步的探索。

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[责任编辑 孔晶晶]endprint