裴高升，王萌，张慧杰，孙立丽，任晓亮，邓雁如，戚爱棣

(1.天津中医药大学 中药学院，天津 300193；2.天津中医药大学 中医药研究院，天津 300193)

·中药基础·

葛根素在水溶液中的降解动力学研究△

裴高升1，王萌2，张慧杰1，孙立丽1，任晓亮1，邓雁如1，戚爱棣1

(1.天津中医药大学 中药学院，天津 300193；2.天津中医药大学 中医药研究院，天津 300193)

目的：研究葛根素水溶液在不同的pH、温度、离子强度、初始浓度条件下降解反应的动力学特征。方法：采用高效液相色谱法考察不同条件下葛根素含量随时间的变化，利用化学反应动力学的方法计算葛根素在不同环境下的降解反应动力学参数，预测其半衰期(t1/2)和活化能。结果：葛根素在不同环境条件下的降解反应均遵循一级动力学规律，在中性pH环境中最为稳定，碱性条件下较容易降解，离子强度和初始浓度对其降解影响不大。结论：葛根素在水溶液中较为稳定，仅在强酸和强碱环境下发生降解，呈现pH和温度依赖性，提示葛根素的保存适宜在低温中性条件下，避免极端的pH和高温条件。

葛根素；水溶液；降解动力学

葛根素(Puerarin)是从豆科植物野葛Perarialobata、甘葛藤PuerariathomsoniiBenth根中提取的一种黄酮苷，属于异黄酮类，其化学式名8-β-D-吡喃葡萄糖基-4′，7-二羟基异黄酮。作为中药葛根中的指标性成分，研究表明，葛根素具有广泛的药理活性：如治疗心脑血管系统疾病[1-3]、镇痛[4]、治疗糖尿病及相关眼底疾病[5-6]、突发性耳聋[7]、骨质疏松[8]及抗肿瘤[9]等，含有葛根的制剂包括注射剂、滴眼剂、片剂等多种剂型[10]，在临床上已被广泛应用。由于葛根素为黄酮苷类化合物，其在水溶液中可能发生氧化、水解等多种降解反应[11-12]，本实验依照《人用药物注册技术要求国际协调会》(ICH)指导原则，采用化学反应动力学方法研究了葛根素水溶液在不同pH、温度、离子强度及初始浓度等条件下的降解规律，以期为含有葛根素的药物的制剂研究、贮藏条件及合理应用提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 试剂和药品

葛根素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110752-200912)；甲醇(色谱纯，SPECTRO，美国TEDIA)；纯水(由Milli-Q纯水器制备)；氢氧化钠(NaOH，分析纯，天津市北方天医化学试剂厂)；盐酸(HCl，分析纯，天津化学试剂一厂)。

1.2 仪器

Waters高效液相色谱系统(600E HPLC pump，2487 Dualλ Absorbance Detecter，Empower色谱工作站)；AX205分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；XW-80A微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)；恒温水浴(天津市泰斯特仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 HPLC检测条件

色谱柱：Agilent C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：水-甲醇(72∶28，V/V)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：250 nm；温度：25 ℃。

在该色谱条件下，葛根素可在10 min内完成检测(保留时间7.8 min)，降解产物不会干扰测定(见图1)。

配制系列浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg·mL-1的葛根素对照品溶液，按上述色谱条件测定，以峰面积(Y)为纵坐标，质量浓度(X，μg·mL-1)为横坐标进行线性回归，得回归方程：Y=1.1274×104X-1 288.3，r=0.999 8，结果表明分析方法在葛根素浓度0.1～5.0 μg·mL-1线性关系良好。取质量浓度为1.0 μg·mL-1的对照品溶液，重复进样6次，测得葛根素峰面积的RSD=0.8%，结果表明此法精密度良好。

注：1.葛根素。图1 葛根素HPLC色谱图

2.2 对照品溶液的制备

精密称取葛根素对照品2.70 mg，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，配制得到质量浓度为0.270 mg·mL-1的葛根素储备液。

吸取上述葛根素储备液100 μL，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，配制得到质量浓度为2.70 μg·mL-1的葛根素对照品溶液。

2.3 葛根素稳定性研究

2.3.1 pH值对稳定性的影响 为了考察pH值对葛根素稳定性的影响，采用HPLC测定了一段时间内葛根素在不同pH值水溶液中的含量变化，得到不同pH值下葛根素的降解动力学曲线并计算降解速率常数k。

2.3.1.1 样品溶液的制备 pH 2～6水溶液：分别向100 mL纯水中加入适量HCl，由精密pH计测定pH值，配制成pH 2～6水溶液。

pH 7水溶液：为纯水，由精密pH计测定pH值为7。

pH 8～12水溶液：分别向100 mL纯水中加入适量NaOH，由精密pH计测定pH值，配制成pH 8～12水溶液。

精密吸取葛根素储备液(0.270 mg·mL-1)100 μL于10 mL棕色量瓶中，用已配制好的不同pH值的水溶液定容至刻度，摇匀即得，该样品溶液中葛根素的起始质量浓度为2.70 μg·mL-1。

2.3.1.2 样品的测定与结果 为了排除光照的影响，所有样品均置于棕色容量瓶中，由于葛根素在常温下降解较为缓慢，故所有样品均放入80 ℃水浴中。每隔一定时间，精密吸取样品溶液20 μL注入高效液相色谱仪，测定葛根素峰面积，计算样品中葛根素的含量。

以葛根素即时质量浓度与初始质量浓度比的对数ln(Ct/C0)为纵坐标，水解时间为横坐标作图，得到在不同pH值条件下葛根素的降解动力学曲线(见图2)。线性回归得到在不同pH值条件下葛根素的降解速率常数及其他动力学参数，结果表明葛根素在不同pH值水溶液中的降解过程符合一级动力学规律。见表1。

图2 不同pH值80 ℃下葛根素的降解动力学曲线

表1 80 ℃不同pH值下葛根素的降解动力学参数

以ln(k)为纵坐标，pH值为横坐标作图，得到pH值与葛根素降解速率的关系图(见图3)。可知，葛根素在中性偏碱条件下(pH=8)比较稳定，在强酸碱条件下均可降解，尤其在强碱条件下，降解反应速率最高。推测出水解反应可能是氢离子及氢氧根离子催化下的反应。

图3 80 ℃下葛根素在不同pH值降解速率常数比较

2.3.2 温度对稳定性的影响

2.3.2.1 样品溶液的制备 pH 12水溶液的配制：同2.3.1.1项下方法。精密吸取葛根素储备液(0.270 mg·mL-1)100 μL于10 mL棕色量瓶中，用pH 12水溶液定容至刻度，摇匀即得，该样品溶液中葛根素的起始质量浓度为2.70 μg·mL-1。

2.3.2.2 样品的测定与结果 将配制好的样品溶液分别放置于70、80、90 ℃的恒温水浴中，每隔一定时间，精密吸取样品溶液20 μL注入高效液相色谱仪，测定葛根素峰面积，计算样品中葛根素的含量。

以ln(k)为纵坐标，1/T为横坐标作图，得到温度对葛根素降解速率的影响，如图4所示。由该线性方程可以计算出不同温度下的降解速率常数，通过阿仑尼乌斯方程可计算降解反应的活化能为48.0 kJ·mol-1。

图4 不同温度下葛根素的降解速率常数

2.3.3 离子强度对稳定性的影响

2.3.3.1样品溶液的制备 pH 12水溶液的配制：同2.3.1.1项下的方法。精密吸取葛根素储备液(0.270 mg·mL-1)100 μL于10 mL棕色量瓶中，用pH 12水溶液定容至刻度，摇匀得样品1。精密吸取葛根素储备液(0.270 mg·mL-1)100 μL于10 mL棕色量瓶中，加入含有0.5 mol·L-1NaCl的pH 12水溶液定容至刻度，摇匀得样品2。

2.3.3.2 样品的测定与结果 将葛根素样品保存在棕色容量瓶中，80 ℃水浴中放置。每隔一定时间，分别精密吸取上述各样品溶液20 μL注入高效液相色谱仪，测定葛根素峰面积，计算样品中葛根素的含量。结果表明，含有0.5 mol·L-1NaCl的pH 12的水溶液与不含NaCl的水溶液葛根素的降解速率常数分别为0.023 5与0.026 7，降解反应略微变快，表明Na+、Cl-一定程度上可加快葛根素的水解反应，但并不明显。

2.3.4 初始浓度对稳定性的影响

2.3.4.1 样品溶液的制备 pH 12水溶液的配制：同2.3.1.1项下的方法制备。精密吸取葛根素储备液(0.270 mg·mL-1)50、100、200 μL分别置于10 mL棕色量瓶中，用pH 12水溶液定容至刻度，摇匀即得，各样品溶液中葛根素的起始质量浓度为1.35、2.70、5.40 μg·mL-1。

2.3.4.2 样品的测定与结果 将葛根素样品保存在棕色容量瓶中，80 ℃水浴中放置。每隔一定时间，精密吸取样品溶液20 μL注入高效液相色谱仪，测定葛根素峰面积，计算样品中葛根素的含量。

对降解结果加以分析，以降解速率常数对3个样品质量浓度进行作图，结果见图5。由图可知，葛根素的起始浓度不同，反应速率变化不大，因此对于葛根素，反应物初始质量浓度对反应速率的影响不大。

图5 初始质量浓度对葛根素降解速率的影响

3 结论

研究表明葛根素在不同pH及温度条件下的降解过程均遵循一级动力学规律。葛根素的初始质量浓度对其强碱性环境下降解反应速率没有明显影响，Na+、Cl-的引入会略微增大葛根素在强碱性环境下的降解反应速率。pH值、温度对葛根素的降解过程有显著的影响，其降解过程呈现pH与温度依赖性。

葛根素在pH=8的近中性水溶液环境中最为稳定，随着酸性及碱性的增加，葛根素的降解速率逐渐增快，但较一般的苷键水解反应难以发生，这是因为苷类成分水解难易与苷键原子接受质子能力强弱有关，苷键原子越易质子化则越易水解，在碳苷中，因碳原子无游离电子对，难以质子化，故碳苷较难水解而较为稳定。

通过该研究结果表明，葛根素适宜在低温中性条件下保存，极端的pH和高温均会造成其快速分解，在开发和应用含有葛根素的药物时应避免上述条件的出现。

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StudiesonDegradationKineticsofPuerarininAqueousSolution

PEIGaosheng1，WANGMeng2，ZHANGHuijie1，SUNLili1，RENXiaoliang，DENGYanru1，QIAidi1

(1.CollegeofTraditionalChineseMedicine，TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine，Tianjin300193，China；2.InstituteofTraditionalChineseMedicine，TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine，Tianjin300193，China)

Objective：To investigate the degradation kinetic characteristics of puerarin in aqueous solution under different pH and temperatures.Methods：The concentration change of puerarin in aqueous solution was determined by HPLC under different pH and temperatures.Based on the chemical reaction kinetic，the parameters of degradation kinetics were calculated.The activation energy and half-life were evaluated.Results：The results indicated that thermal degradation kinetic model of puerarin in aqueous solution follows first-order degradation kinetic process.Conclusion：Puerarin was more stable in neutral aqueous solution and low temperature condition.The degradation of puerarin can be observed in both strong acid and strong alkali conditions.

Puerarin；aqueous solution；degradation kinetics

2016-06-22)

国家自然科学基金面上基金项目(81473543)

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任晓亮，博士，副教授，研究方向：中药质量评价研究；Tel：(022)59596221，E-mail：xiaoliang_ren@sina.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.3.014