唐思丽，王声，孙明娜，赵小琴，黄文菁，刘韵，林敏婷，张建业*

(1.广州医科大学 药学院，广东 广州 511436；2.广东省妇幼保健院，广东 广州 511400)

·基础研究·

莪术活性成分的分离鉴定及活性研究△

唐思丽1，王声1，孙明娜1，赵小琴2，黄文菁1，刘韵1，林敏婷1，张建业1*

(1.广州医科大学 药学院，广东 广州 511436；2.广东省妇幼保健院，广东 广州 511400)

目的：研究莪术乙酸乙酯提取物中的化学成分，探讨莪术活性成分对肺癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法：乙酸乙酯试剂提取莪术、减压浓缩得到莪术提取物，采用硅胶柱色谱分离方法对提取物进行分离，所得单体成分结合MS、13C-NMR、1H-NMR，并查阅相关文献进行结构鉴定。MTT法和划痕实验检测莪术活性成分对肺癌细胞的增殖和迁移能力的影响。结果：从莪术乙酸乙酯提取物中分离得到1个倍半萜类单体化合物，鉴定为(5R，6R，7aS)-7a-羟基-5-异丙烯基-3，6-二甲基-6-乙烯基-5，6，7，7a-四氢-4H-苯并呋喃-2-酮(化合物1)。MTT法提示化合物1可抑制PC-9细胞的生长，细胞划痕实验发现化合物1作用的PC-9细胞的迁移能力相比于对照组降低。结论：从莪术乙酸乙酯提取物中分离鉴定得到单体化合物(5R，6R，7aS)-7a-羟基-5-异丙烯基-3，6-二甲基-6-乙烯基-5，6，7，7a-四氢-4H-苯并呋喃-2-酮，且其对PC-9细胞增殖和迁移能力有抑制作用。

莪术；活性成分；分离鉴定；细胞增殖；细胞迁移

莪术为姜科植物蓬莪术CurcumaphaeocaulisVal.、广西莪术CurcumaKwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang或温郁金CurcumawenyujinY.H.Chen et C.Ling的干燥根茎。辛、苦，温，归肝、脾经。具有行气破血，消积止痛的功效。用于癥瘕痞块，瘀血闭经，胸痹心痛食积胀痛[1]。现代药理研究，莪术具有多种活性成分，有抗肿瘤[2]、抗血栓和抗凝血[3]等作用。

肺癌是全世界发病率最高的恶性肿瘤，严重威胁着人类的健康。化疗是治疗肺癌主要手段之一，但仍不能根治疾病，因此寻找新的药物显得尤为重要。本研究从莪术中分离鉴定出(5R，6R，7aS)-7a-羟基-5-异丙烯基-3，6-二甲基-6-乙烯基-5，6，7，7a-四氢-4H-苯并呋喃-2-酮(化合物1)，并探讨其对人肺癌PC-9细胞的增殖和迁移能力的影响，为进一步研发治疗肺癌的新药提供科学依据。

1 仪器与材料

MAT95XP高分辨ESI-TOF仪(Thermo公司)；Varian Inova核磁共振仪(美国Varian公司)；CO2细胞培养箱(Thermo公司)。

本实验所用莪术产地为广西，购于清平药材市场，经香港浸会大学陈虎彪教授鉴定为广西莪术CurcumaKwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang的根茎。DMEM培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Media)、胎牛血清(GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四氮唑溴盐(MTT，MP Biomedicals公司)；乙酸乙酯、石油醚、甲醇等溶剂为分析纯；薄层色谱硅胶 GF254及薄层色谱硅胶 H、柱色谱硅胶200～300目(青岛海洋化工有限公司)；磷钼酸(天津市津科精细化工研究所)。

2 方法

2.1 提取方法

取莪术干燥药材粉碎，按乙酸乙酯与药材5∶1的比例加入到5000 mL圆底烧瓶中加热回流3次，每次3 h。将3次所得到的提取液进行合并，静置，冷却，过滤，浓缩，得到总提取物浸膏。

2.2 分离与纯化方法

样品进行洗脱前，通过薄层色谱确定洗脱液为石油醚-乙酸乙酯-甲醇。当极性不同的组分之间的Rf值相差较大时，可将不同组分洗脱。

取100 g乙酸乙酯提取的浸膏用适量乙酸乙酯稀释，用1 kg硅胶(200～300目)拌样，采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇进行梯度洗脱，每1000 mL的洗脱液作为1个流分进行收集，再进行减压浓缩。

将浓缩液进行薄层点板，展开剂为石油醚-乙酸乙酯(10∶1～2∶1，加0.1%的甲酸)，于紫外分析仪下检测，并用5%浓硫酸-乙醇溶液及5%磷钼酸-乙醇溶液显色，将各组分点板结果进行对比并将成分相同组分合并，结晶。

2.3 结构鉴定

将得到的化合物进行MS、13C-NMR、1H-NMR等波谱手段分析，并与文献对照，鉴定分离单体化合物。

2.4 药理活性研究

用含青霉素(100 U·mL-1)、链霉素(100 g·mL-1)和10%胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养PC-9细胞。

2.4.1 MTT法检测化合物对PC-9细胞增殖的影响 取对数生长期的PC-9细胞，以1.5×104个·mL-1接种于96孔培养板中。孵育24 h后，加10 μL不同浓度的化合物于96孔培养板，每个剂量设4个平行孔，对照组仅加DMEM培养基，同时选用长春新碱作为阳性对照药物。72 h后，每孔加入10 μL的MTT溶液。孵育4 h，弃去培养液，每孔加100 μL无水DMSO溶液，震荡10 min。用酶标仪540/655 nm双波长测定吸光值，实验至少进行3次。根据吸光度值计算细胞生长抑制率、药物的半数抑制质量浓度，观察不同浓度化合物对细胞的增殖抑制作用。细胞生长抑制率(%)=(1-实验组吸光度/对照组吸光度)×100%，IC50为细胞生长抑制率为50%的药物质量浓度。

2.4.2 划痕实验检测化合物对PC-9细胞迁移能力的影响 取对数生长期的PC-9细胞，以1.5×106个·mL-1接种于6孔培养板中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养孵育至上述细胞相互融合时，用20 μL枪头垂直于皿底在单层细胞上划痕，划痕后用PBS轻柔清洗细胞3次，加入无血清的DMEM和化合物，使化合物的终浓度为10、20、40 μM，对照组仅加入无血清的DMEM在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育，0、24、48 h后置于倒置显微镜下观察并拍照。测量划痕距离，用GraphPad Prism 5分析细胞运动迁移情况。

3 结果

3.1 化合物的分离结果和结构鉴定

用MS、13C-NMR、1H-NMR等波谱手段并结合相关参考文献对白色结晶单体化合物进行鉴定，得到其平面结构为(5R，6R，7aS)-7a-羟基-5-异丙烯基-3，6-二甲基-6-乙烯基-5，6，7，7a-四氢-4H-苯并呋喃-2-酮，具体分析如下：

根据MS，得到分子离子峰[M+H]+m/z 249，结合13C-NMR、1H-NMR推测出单体化合物分子式为C15H20O3，通过分子式计算不饱和度为6。

13C-NMR谱显示有15条谱线，其中δ 100～180之间有8个碳信号，包括δ 172.7的羰基碳信号，δ 160.7～111.9之间的6个烯碳的信号(提示可能含有三个双键)，δ 103.3连氧碳信号。通过与分子式计算得到的不饱和度相比，推测该化合物可能含有2个环。

1H-NMR谱上共显示有19个氢质子信号，与分子式相比少了1个氢质子信号，推测结构中有1个羟基。低场区的δ 5.70(1H，dd，J=10.5，17.0 Hz)，δ 4.99(1H，dd，J=5.5，10.5 Hz)，δ 4.97(1H，dd，J=5.0，17.0 Hz)，δ 4.98(1H，s)，δ 4.73(1H，s)为烯氢信号；δ 1.82(3H，s)，δ 1.77(3H，s)，δ 1.27(3H，s)为甲基的氢质子信号。

经文献[4-5]检索，白色结晶单体化合物的波谱数据与(5R，6R，7aS)-7a-羟基-5-异丙烯基-3，6-二甲基-6-乙烯基-5，6，7，7a-四氢-4H-苯并呋喃-2-酮的波谱数据基本一致，故鉴定化合物1为(5R，6R，7aS)-7a-羟基-5-异丙烯基-3，6-二甲基-6-乙烯基-5，6，7，7a-四氢-4H-苯并呋喃-2-酮。化合物1的1H-NMR谱 和13C-NMR谱数据见表1，结构式见图1。

图1 化合物1的结构式

表1 化合物1的1H-NMR和13C-NMR数据(CDCl3)

3.2 化合物1抑制PC-9细胞增殖和迁移

MTT实验结果表明，阳性对照药物长春新碱对PC-9细胞的 IC50值为0.01± 0.001 μM，化合物1对PC-9细胞的 IC50值为21.12 ± 0.56 μM，表明化合物1对PC-9细胞生长表现出较强的抑制活性，为进一步的研究提供依据。

细胞划痕实验可以检测细胞自身的运动迁移能力，本实验用这种方法检测化合物1浓度为10、20、40 μM作用于PC-9细胞0、24、48 h后细胞的迁移情况。划痕结果显示，对照组和化合物1浓度为10、20、40 μM的组在0 h时，划痕距离大体相同。24 h后，对照组与化合物1浓度为10、20、40 μM组的划痕距离缩短，48 h划痕的距离相比24 h的距离更短，划痕的距离与化合物1作用于PC-9细胞的浓度有关，化合物1浓度为10、20、40 μM的组随着浓度增高划痕距离增宽，细胞迁移率降低。不同浓度的化合物1作用于 PC-9细胞的迁移情况见图2。

注：A.对照组及10、20、40 μM化合物1作用于PC-9细胞0、24、48 h的划痕图；B.对照组及10、20、40 μM化合物1作用于PC-9细胞0、24、48 h迁移率与浓度之间关系的柱状图。图2 不同浓度的化合物1作用于PC-9细胞的迁移情况

4 讨论

本实验采用硅胶柱色谱分离法、MS、13C-NMR、1H-NMR等手段分离鉴定化合物1。查阅相关的文献，发现只有极少数的文献[4-5]报道该化合物。其原因可能是化合物1中8位的羟基在莪术生长过程中与其他物质发生反应，导致以化合物1形式存在的含量极少；其次可能因莪术的产地、莪术采集的时间的不同导致所含的化学成分有所差异；另外也可能是研究方法和研究条件不一致，例如提取的条件，这需要进一步的研究证明。

恶性肿瘤因其高发病率和高死亡率的特征，已经成为全球公共卫生问题之一，极大地危害着人类的健康[6]。陈万青等[7-8]报道2010年、2011年我国恶性肿瘤发病第一位是肺癌，且呈逐年升高趋势，故研究开发能够治疗肺癌的药物刻不容缓。本实验以肺癌细胞系PC-9细胞为研究对象，探究化合物1对PC-9细胞的增殖和迁移能力的影响，这有利于发掘化合物1作为抗癌药物的潜力。 MTT实验结果表明，化合物1对PC-9细胞的 IC50值为21.12 ± 0.56 μM，具有较强的生长抑制作用；同时细胞划痕实验也表明随着化合物1浓度的增大，细胞的迁移率逐渐降低，表明化合物1具备作为抗癌药物的潜力，这也为肿瘤的治疗提供了一种新的治疗方法和治疗方向。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部 [S].北京：中国医药科技出版社，2015：274-275.

[2] 姜苗，郭晶，陈文强.莪术醇体外抗肿瘤作用的研究[J].北京中医药，2014，33(8)：623-626.

[3] 王秀，夏泉，许杜娟，等.莪术中莪术二酮抗凝血和抗血栓作用的实验研究[J].中成药，2012，34(3)：550-553.

[4] 刘晓宇.中药温莪术挥发油化学成分的研究[D].沈阳：沈阳药科大学，2004.

[5] Dirk Friedrich，Ferdinand Bohlmann.Total Synthesis of Various Elemanolides [J].Tetrahedron，1988，44(5)：1369-1392.

[6] 吴菲，林国桢，张晋昕.我国恶性肿瘤发病现状及趋势[J].中国肿瘤，2012，21(2)：81-85.

[7] 陈万青，张思维，曾红梅，等.中国2010年恶性肿瘤发病与死亡[J].中国肿瘤，2014，23(1)：1-10.

[8] 陈万青，郑荣寿，曾红梅，等.2011年中国恶性肿瘤发病和死亡分析[J].中国肿瘤，2015，24(1)：1-10.

Isolation，IdentificationandActivityAssayofActiveIngredientsofRhizomaCurcumae

TANGSili1，WANGSheng1，SUNMingna1,ZHAOXiaoqin2，HUANGWenjing1，LIUYun1，LINMinting1，ZHANGJianye1*

(1.SchoolofPharmaceuticalSciences，GuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou511436，China;2.GuangWomanandChidrenHospotalandHealthInstitute,Guangzhou511400,China)

Objective：To investigate constituents fromRhizomaCurcumaeextracts，and study their effects on proliferation，migration of PC-9 cells.Methods：TheRhizomaCurcumaeextracts were obtained through ethyl acetate extraction and vacuum concentration.They were then isolated by silica gel column chromatography method.The structure of composition was confirmed by various spectral methods，including MS，13C-NMR，1H-NMR data.MTT assay and scratch assay were used to evaluate the effect of constituents on cell proliferation and cell migration.Results：One monomer component belonging to sesquiterpenes was isolated fromRhizomaCurcumaeand identified as(5R，6R，7aS)-7a-hydroxy-5-isopropenyl-3，6-dimethyl-6-vinyl-5，6，7，7a-tetrahydro-4H-benzofuran-2-one(compound 1).MTT assay showed that the growth of PC-9 cells which were treated with compound 1 was inhibited.Scratch assay demonstrated that cell migration was reduced when the PC-9 cells were treated with compound 1.Conclusion：Compound 1 isolated from ethyl acetate portion was identified as(5R，6R，7aS)-7a-hydroxy-5-isopropenyl-3，6-dimethyl-6-vinyl-5，6，7，7a-tetrahydro-4H-benzofuran-2-one.Compound 1 has an effect on PC-9 cells and inhibits the cell proliferation and cell migration.

RhizomaCurcumae；active ingredients；cell proliferation；cell migration

2016-06-21)

广东省科学技术厅项目(2016A020226024)；广州市属高校科研项目(1201410039)；广东省教育厅项目(2015KTSCX112)

*

张建业，副教授，研究方向：中药化学；Tel：(020)37103255，Email：jianyez@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.3.010