徐靖，王晓彤，胡凌娟，李明焱，邵清松，贾宸

(1.浙江寿仙谷医药股份有限公司，浙江 武义 321200；2.浙江省珍稀植物药工程技术研究中心，浙江 武义 321200；3.金华寿仙谷药业有限公司，浙江 武义 321200；4.浙江农林大学 中药学科，浙江 杭州 311300)

·专题·

铁皮石斛新品种“仙斛3号”的选育及特征特性研究△

徐靖1，2*，王晓彤3，胡凌娟3，李明焱1，2，邵清松4，贾宸4

(1.浙江寿仙谷医药股份有限公司，浙江 武义 321200；2.浙江省珍稀植物药工程技术研究中心，浙江 武义 321200；3.金华寿仙谷药业有限公司，浙江 武义 321200；4.浙江农林大学 中药学科，浙江 杭州 311300)

目的：在以往研究工作基础上，选育出铁皮石斛优良品种，促进铁皮石斛产业健康发展。方法：通过杂交、诱变、筛选等方法，选育出高产、优质的铁皮石斛新品种。结果：获得了适应性及抗逆性强、产量高的铁皮石斛新品种“仙斛3号”。与对照品种“新黑”、“仙斛1号”比较，“仙斛3号”新鲜茎叶、茎产量以及浸出物含量均显著高于对照品种。SSR分子标记分析表明“仙斛3号”与石斛属其他品种(系)存在明显遗传差异。结论：“仙斛3号”是继“仙斛2号”之后又一个铁皮石斛新品种，为铁皮石斛的合理开发利用与保护提供方向与依据。

铁皮石斛；仙斛3号；SSR标记；选育；特征特性

铁皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo 属兰科多年生附生草本植物，主要产于浙江、四川、云南、贵州等地[1]。《本草纲目》称其具有“强阴益精，厚肠胃，补内绝不足，长肌肉，益智除惊，轻身延年”的作用[2]。但是铁皮石斛自然繁殖率低，对环境要求较高，长期以来遭受人类过度采集，其野生资源匮乏[3]。1987年国务院将铁皮石斛列入野生药材重点保护物种，禁止流通贸易，铁皮石斛因此成为具极高附加值的非主要农作物(中药材)种类[4]。研究表明，铁皮石斛中含有大量的多糖，具有较强的抗肿瘤和增强免疫力功能[5-7]。研究团队长期以来从事铁皮石斛种质资源收集、评价、新品种选育工作，先后选育出“仙斛1号”、“仙斛2号”等铁皮石斛新品种。本研究以“仙斛1号”(作父本)和“514”号”(作母本)杂交得到F1代蒴果进行航天搭载，并对诱变蒴果进行人工筛选，获得了一个新的铁皮石斛新品种“仙斛3号”，该品种于2016年1月通过了浙江省非主要农作物审定，本文主要对该品种的特征特性进行详细的研究，以便为其更大范围的推广种植提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以“新黑”和本单位选育并通过认定的“仙斛1号”为对照品种开展品比试验。“仙斛3号”为试验对象，其来源为2005～2008年以“仙斛1号”作为父本和“514号”为母本杂交得到的蒴果F1M514，经航天搭载得到航天诱变蒴果H-F1M514，经无菌播种、组织培养、筛选所得(见图1)。

图1 “仙斛3号”植株

1.2 试验材料扩繁及栽培

参照李明焱等[2]研究报道，组织培养采用改良的MS培养基，以茎段和种子为组织培养外植体。4～6月份移栽组培苗，以食用菌废料、木屑、石粉、菜饼等按一定比例混合、发酵为栽培基质，采用丛栽方法，每丛3～4株苗，行距为20 cm×15 cm，移栽后加强湿度控制，促进根部生长，提高成活率。同时加强棚内温度、湿度、光照、空气、基质含水量及病虫害的管理，促其正常生长。

1.3 品比试验

以“新黑”和“仙斛1号”作为对照品种，在杭州(浙江中信药用植物种业有限公司杭州基地)、建德(杭州小香生态农业科技有限公司建德基地)、武义(金华寿仙谷药业有限公司源口种植基地)各设一个试验点，每个点重复3小区，每小区面积9 m2。移栽定植后，分别隔12个月、24个月、36个月，从每小区随机取3丛铁皮石斛用于测定产量、灰分、浸出物、峰面积比和石斛多糖、甘露糖含量。产量测定时，比较新鲜茎叶产量，同时去叶比较新鲜茎的产量。石斛多糖含量测定参照《中华人民共和国药典》方法[8]，计算干品多糖百分率。

1.4 显微结构分析

以“仙斛3号”新鲜茎、叶为材料，采用石蜡切片技术制作植物组织切片；新鲜的叶鞘制备成水封片。采用固绿和番红染色，中性树胶封片，然后在高倍显微镜下进行显微结构观察并摄像。

1.5 SSR分子标记

为鉴别“仙斛3号”与其他铁皮石斛在DNA水平上的差异，采用SSR分子标记技术进行了分析。选用“仙斛3号”及其他13种石斛属的新鲜嫩叶为实验材料，采用QIAGENE提取试剂盒从叶片中提取DNA。PCR结果应用Quantity one软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 “仙斛3号”的植物学形态特征

“仙斛3 号”茎圆柱形，长约8～21 cm，粗约2～6 mm，不分枝，具多节，节间长约0.8～1.4 cm，常在中部以上互生6～12枚叶。质地坚脆，易折断，断面绿色，呈细颗粒黏质状物。叶片稍带肉质，长圆状披针形，长约2～7 cm，宽约0.8～2.2 cm，先端钝并且在叶尖部钩转，基部下延为抱茎的鞘，边缘和中肋常带紫色斑点。叶鞘初生时与茎包裹严密，老时其上缘与茎松离而张开，变为灰白色，膜质，棱条更明显，紫色斑点渐褪去。有时叶鞘顶部边缘可超出上一茎节。总状花序生于落了叶的老茎上部，具3～5朵花，花序轴长约4～6 cm，稍回折状弯曲。唇瓣黄白色，基部具1个绿色或黄色的胼胝体，卵状披针形，比萼片稍短，中部反折，先端急尖，不明显3裂，中部以下两侧具紫红色条纹；唇盘密布细乳突状的毛，并且在中部以上具1个紫红色斑点。

2.2 “仙斛3号”的产量及品质表现

2011—2013年，在浙江杭州市、建德市、武义县3地进行了两轮连续3年的品种比较试验，分别测定了移栽后12个月、24个月、36个月的新鲜茎叶产量。结果表明，“仙斛3号”12个月3地两轮平均新鲜茎叶产量为0.659 kg·m-2，比对照品种“新黑”和“仙斛1号”分别增产52.10%和 20.91%；24个月3地两轮平均新鲜茎叶生长量为2.515 kg·m-2，比对照品种“新黑”和“仙斛1号”分别增产65.57%和17.74%；36个月3地两轮平均新鲜茎叶生长量为3.205 kg·m-2，比对照品种“新黑”和“仙斛1号”分别增产50.33%和26.80%，且均显著高于对照品种“新黑”和“仙斛1号”，见表1。

在实验中通过汇总灰分、浸出物、多糖、甘露糖、峰面积比来比较“仙斛3号”与对照品种品质的区别。结果表明，“仙斛3号”灰分和甘露醇均显著高于对照品种“新黑”和“仙斛1号”；“仙斛3号”灰分两轮平均为5.346%，较“新黑”和“仙斛1号”分别增加16.73%和26.84%。浸出物两轮平均为13.845%，较“新黑”和“仙斛1号”分别增加58.43%和67.47%。多糖和甘露糖含量均显著低于对照品种“新黑”和“仙斛1号”。多糖含量两轮平均为33.410%，较“新黑”和“仙斛1号”分别减少18.65%和10.4%。甘露醇含量两轮平均为21.753%，较“新黑”和“仙斛1号”分别减少29.54%和16.06%。两轮三地试验结果表明，“仙斛3号”各项品质指标均符合《中华人民共和国药典》要求，见表2。

表1 “仙斛3号”与“新黑”和“仙斛1号”鲜品产量比较 kg·m-2

注：相同小写字母表示同列数据无统计学差异(P>0.05)；不同小写字母表示同列数据有统计学差异(P<0.05)；下同。

表2 “仙斛3号”与对照品种品质比较

2.3 “仙斛3号”的显微结构

茎切片结果显示：1)表皮细胞由1列细胞组成，扁平，外被黄色角质层，边缘呈不规则波状。每2个波状中夹有一个深波状弯曲，外层可见无色的薄壁细胞组成的叶鞘层。2)基本薄壁组织细胞呈多角形，大小不一，占据茎横切面的绝大部分，薄壁细胞长约23～85 μm，宽约7～47 μm，多数维管束散在其间。3)维管束为有限外韧型，维管束横截面面积约为3850 μm2，略排成3～5圈，其中纤维细胞直径约为4～6 μm。见图2。

图2 “仙斛3号”茎横切面石蜡切片显微结构图

叶鞘显微鉴定结果：叶上表皮排列紧密，多角形，壁薄，增厚不明显；上表皮细胞长约为56～81 μm、宽约为45～48 μm。上表皮无气孔(见图3A、3B)。下表皮排列紧密，长方形，呈行排列，壁增厚；下表皮细胞长约为30～66 μm、宽约为12～29 μm；气孔分布松散，呈肾形，在230～470 μm2面积内分布3个气孔，气孔长度约为24 μm、宽度约为16 μm，气孔指数为16%(见图3C、3D)。叶鞘细胞排列紧密不规则，形状多种，增厚不明显；可见紫色斑点，成群散列分布。叶鞘细胞长度约为21～40 μm，宽约为19～30 μm(见图3E、3F)。

注：A.叶上表皮(×100)；B.叶上表皮(×400)；C.叶下表皮(×100)；D.叶下表皮(×400)；E.叶鞘细胞(×100)；F.叶鞘细胞(×200)。图3 “仙斛3号”叶及叶鞘水封片显微结构图

2.4 “仙斛3号”与其他铁皮石斛的SSR分子标记分析

采用QIAGENE提取试剂盒从叶片中提取DNA，采用稳定性高、重复性好、共显性的SSR分子标记方法，从公开发表的铁皮石斛基因组特异的SSR 分子标记中进行筛选。经过筛选，获得可以完全区分“仙斛3号”的3个多态性条带丰富的SSR分子标记：OA15、XML003和XML006(见表3)。结果表明，采用OA15和XML003两个分子标记能够将“仙斛3 号”(编号1)与其他样品区分开，而其他样品之间的差异可以从OA15、XML003、XML006 3个分子标记中区分(见图4)。从带型分析，OA15基本上可以将“仙斛3号”与石斛属的其他种区分开。因此，从这两个SSR分子标记的PCR结果可以看出“仙斛3号”在遗传上具有特异性，区别于石斛属的其他种。

表3 区分“仙斛3号”与其他13份石斛属材料的SSR分子标记

注：A.OA15；B.XML003；C.XML006；M.Marker。图4 “仙斛 3 号”及其他13份石斛属材料SSR分子标记分析

3 讨论

野生铁皮石斛由于生长条件苛刻，自然产量极为稀少，更因民间长期过度采挖，致使野生资源濒临绝种。我国目前的石斛栽培生产仍然处于起步阶段，产业发展前景十分广阔[2]。“仙斛3号”是继“仙斛1号”后选育的第3个铁皮石斛品种。从品种比较试验可以看出，“仙斛3号”具有高产、优质、生长迅速等特点；综合性状与“新黑”和“仙斛1号”有明显差异；在产量上，明显优于“仙斛1号”；其干品石斛多糖和甘露糖含量要低于“新黑”和“仙斛1号”。铁皮石斛的品质指标目前主要按照《中华人民共和国药典》的要求，比较多糖和甘露糖含量，“仙斛3号”多糖和甘露糖的含量均符合《中华人民共和国药典》规定[8]。显微结构鉴定是生物学鉴定的常用手段，本研究的显微结构鉴定与文献描述一致，可以认为“仙斛3号”具有铁皮石斛典型结构特征。PCR结果可以看出“仙斛3号”在遗传上具有特异性，区别于石斛属的其他种。“仙斛3号”的培育，对铁皮石斛在健康产业方面的发展，具有重大的推动意义，它为铁皮石斛种植提供了更多的选择，同时为石斛产业提供了品质的保证。

[1] 谢伟杰，张永萍，徐剑，等.铁皮石斛现代研究进展[J].现代中医药，2016，36(4)：87-91.

[2] 李明焱，谢小波，朱惠照，等.铁皮石斛新品种“仙斛1号”的选育及其特征特性研究[J].中国现代应用药学，2011，28(4)：281-284.

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[8] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：282-283.

BreedingofDendrobiumofficinalevar.“Xianhu3”andItsCharacteristics

XUJing1，2*，WANGXiaotong3，HULingjuan3，LIMingyan1，2，SHAOQingsong4，JIAChen4

(1.ZhejiangShouxianguPharmaceuticalCo.Ltd，Wuyi321200，China；2.ZhejiangEngineeringResearchCenterofRarePlantMedicine，Wuyi321200，China；3.JinhuaShouxianguPharmaceuticalCo.Ltd.，Wuyi321200，China；4.DepartmentofTraditionalChineseMedicine，ZhejiangA&FUniversity，Hangzhou311300，China)

Objective：To select and breed elite variety ofDendrobiumofficinaleon the basis of previous research work，thus to promote the healthy developing ofD.officinaleindustry.Methods：Hybridization，mutagenesis，screening etc.was employed for the breeding of high yeild and high quality，new variety developedD.officinale.Results：The adaptability and strong resistance，Dendrobiumnew varieties of high yield “Xianhu 3 ”.Compared with the control variety “Xinhei”，“Xianhu 1”，“Xianhu 3 ” fresh stem leaf，stem yield and extract content were significantly higher than that of CK.SSR molecular marker analysis showed that “Xianhu 3 ” and other species ofDendrobium(lines) have obvious genetic differences.Conclusion：“Xianhu 3 ” was a new elite variety ofDendrobiumvarieties with the following of “Xianhu 2 ”.Its breeding provided direction and basis forD.officinalereasonable development and utilization and protection.

Dendrobiumofficinale；Xianhu 3；SSR marker；breeding；characteristics

2017-01-16)

浙江省中药材新品种选育重大科技专项(2016C02058)；浙江省重点研发计划项目(2017C02011)

*

徐靖，工程师，研究方向：药用植物栽培与育种；Tel：(0579)87980003，E-mail：37117894@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.3.007