刘燕，陈积，胡姗姗，陈泽慧，田应彪*

(1.遵义医学院 药学院，贵州 遵义 563003；2.遵义医学院附属医院，贵州 遵义 563003)

·中药工业·

正交设计法优选胆石六号汤提取工艺△

刘燕1，陈积1，胡姗姗2，陈泽慧2，田应彪2*

(1.遵义医学院 药学院，贵州 遵义 563003；2.遵义医学院附属医院，贵州 遵义 563003)

目的：优选胆石六号汤的最佳提取工艺。方法：以总黄酮、栀子苷含量及干膏率的综合评分为指标，在单因素试验基础上，通过L9(34)正交试验考察加水量、提取时间和提取次数对胆石六号汤水提工艺的影响。结果：最佳提取工艺为加12倍量水，煎煮3次，每次1 h。结论：优选的提取工艺合理可行，为胆石六号颗粒剂的制备提供参考。

胆石六号汤；总黄酮；栀子苷；干膏率；正交试验

胆囊炎、胆结石是常见的胆道系统疾病，位居腹部外科疾病中的第二位，其发病率仅次于急性阑尾炎[1]。目前，本病的治疗主要采用手术治疗和药物治疗，手术治疗的适应症受到患者身体状况、术后综合症的限制，而中医中药的治疗在术前准备和术后恢复都发挥了积极的疗效，越来越受到广大患者的青睐[2]。胆石六号汤是遵义医学院附属医院研制的一种中药口服制剂，由金钱草、木香、栀子等八味中药组成，具有消炎、利胆、解热之功能，主要用于治疗胆囊炎、胆囊结石、重症胆囊炎等症，疗效确切[3-4]。课题组在前期实验中证明，胆石六号汤具解热、镇痛、利胆、抗炎的功能[5]，对大鼠肝脏有一定的保护作用[6]，初步探讨了该制剂防治胆囊炎、抗胆囊结石作用的机制[7-9]，并未发现明显的不良反应[10]。然而，该制剂一直以汤剂形式应用于临床，汤剂有久置易发霉、携带不方便、服用量大、不易贮存等不足。故本实验拟将其改制成颗粒剂，以期克服汤剂的缺点[11]。

目前，尚没有关于胆石六号汤提取工艺的研究报道，为了建立更加全面的胆石六号汤的提取工艺，提高其临床疗效，以总黄酮、栀子苷含量和干膏率的综合评分为评价指标对提取工艺中加水量、提取时间、提取次数进行考察。黄酮类成分为该复方中多种药材的有效成分，药理研究表明，黄酮类化合物具有抗炎、镇痛等活性，还具有抗菌、抑菌等作用，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌等有抑制作用[12-13]。栀子中的有效成分栀子苷具有解热、镇痛、抗炎、利胆等作用[14-15]。本实验采用单因素试验和正交试验对胆石六号颗粒的水提工艺进行优化，利用UV法测定总黄酮含量，HPLC法测定栀子苷含量，为该颗粒剂的后期研究提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1仪器

Agilent1260高效液相色谱仪；T9CS双光束紫外-可见光分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；RE-2000A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-ⅢG循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；DL-820D智能超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)；HH-S6二列六孔水浴锅(郑州长城科工有限公司)；98-Ⅱ-B磁力搅拌电热套(天津泰斯特仪器有限公司)；101-4电热鼓风干燥箱(北京中兴伟业仪器有限公司)；ME204E电子天平(梅勒特-托利多仪器上海有限公司)。

1.2试药

栀子苷对照品(供含量测定用，成都曼斯特生物科技有限公司，批号：151204)；芦丁对照品(国药集团化学试剂公司，批号：160602)；胆石六号处方药材：金钱草(批号：150701)、木香(批号：150801)、虎杖(批号：150701)、枳壳(批号：151001)、栀子(批号：150701)、延胡索(批号：150901)、大黄(批号：140901)、芒硝(批号：150901)均购于遵义医学院附属医院药剂科；甲醇为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1胆石六号颗粒的水提工艺

按处方比例称取金钱草、木香、栀子等药材，依一定的料液比加水煎煮一定的次数，滤过，合并滤液，将滤液浓缩定容至25mL，得水提液样品，备用。

2.2栀子苷含量测定

2.2.1色谱条件 色谱柱：GeminiC18柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-0.3%磷酸溶液(12∶88)；柱温：30℃；检测波长：238nm；流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL。供试品色谱中栀子苷与最近组分的分离度大于1.5，理论塔板数按栀子苷峰计算应不低于4500，见图1。

注：A.对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.栀子苷。图1 胆石六号汤提取液HPLC图

2.2.2对照品溶液的制备 取栀子苷对照品适量，精密称定，置于棕色容量瓶中，加甲醇制成每1mL含23.1μg的栀子苷对照品溶液，置凉暗处保藏，备用。

2.2.3供试品溶液的制备 精密量取提取液2mL，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理40min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

2.2.4阴性供试品溶液的制备 按处方称取不含栀子的其余处方量药材，按2.2.3项下方法制成阴性供试品溶液，即得。

2.2.5标准曲线的制备 精密吸取栀子苷对照品储备液2、4、6、8、10、12、16μL，注入液相色谱仪，按2.2.1项下色谱条件测定，以对照品进样量(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，得栀子苷回归方程Y=331.14X-19.236，(r=0.9999，n=7)，表明栀子苷在0.046～0.368μg线性关系良好。

2.2.6精密度试验 精密吸取栀子苷对照品溶液，按2.2.1项下色谱条件连续进样6次，每次10μL，测定峰面积。测得栀子苷对应峰峰面积的RSD为0.40%，表明仪器精密度良好。

2.2.7稳定性试验 取同一供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24h进样，测定栀子苷的峰面积，计算RSD分别为0.58%，表明样品在24h内基本稳定。

2.2.8重复性试验 取同一批次样品6份，按2.2.3项下方法处理，每份精密吸取10μL，按2.2.1色谱项下测定，测得栀子苷的平均含量为0.253mg·mL-1(n=6)，RSD为2.04%。表明该方法重复性好。

2.2.9加样回收试验 精密量取已知含量的样品溶液6份，精密加入栀子苷对照品溶液1mL，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.2.1色谱项下测定，计算平均加样回收率分别为99.85%，RSD值分别为1.26%，表明该方法准确度良好。

2.3总黄酮含量测定

2.3.1对照品溶液的配制 精密称取芦丁对照品20mg，加70%乙醇适量，使其溶解，用70%乙醇定容至50mL即可。

2.3.2供试品溶液的配制 精密量取提取液1mL，置25mL量瓶中，加70%乙醇20mL，超声处理15min，放冷，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.3.3标准曲线绘制 精密量取芦丁对照品0.5、1、2、3、4、5、6mL，分别置于25mL容量瓶中，加入5%的NaNO2溶液1mL，摇匀，放置6min，再加入10%的硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，最后加入4%的NaOH溶液10mL，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，放置15min。以相应显色剂为空白对照，在510nm处测定吸光度，以溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，其回归方程为Y=12.539X-0.03183，(r=0.9998)，表明芦丁在0.008～0.096mg·mL-1与吸光度呈良好的线性关系。

2.3.4精密度试验 精密吸取芦丁对照品溶液，在波长510nm处按照2.3.3项下测定方法测定吸光度6次，其芦丁吸光度RSD值为0.42%。

2.3.5稳定性试验 取供试品溶液1mL，按2.3.3项下操作，分别于显色后0、5、10、15、20、25、30min测定吸光度，其RSD为0.58%，表明制备的供试品溶液在显色之后30min内稳定。

2.3.6重复性试验 取同一批次样品6份各1mL，于2.3.3项下操作，测得吸光度平均值为0.408(n=6)，RSD为0.37%，表明该方法重复性良好。

2.3.7加样回收率试验 量取已知含量的样品6份，依2.3.2中供试品的制备方法制备溶液，取1mL供试品溶液，采用加样回收试验，分别加入2mL的芦丁对照品溶液(0.4mg·mL-1)，置于25mL容量瓶中，按2.3.3项下步骤进行操作测定其吸光度，平行操作6份，计算其平均加样回收率为98.2%，RSD为0.87%，表明此方法的回收率良好。

2.4干膏率的测定

分别精密量取各实验浓缩液5mL，分别置已干燥至恒重的洁净蒸发皿中，水浴蒸干后，于105 ℃烘箱下干燥3h后取出，放入干燥器中冷却，称重，计算干膏得率[16]。

2.5水提工艺单因素试验

设定其他条件不变的情况下，分别考察提取时间、加水量、提取次数对总黄酮、栀子苷含量综合评分的影响，见表1。

表1 水提工艺单因素变化条件

2.5.1 提取时间对总黄酮、栀子苷含量综合评分的影响 根据图2(A)可知，当煎煮时间为0～1.5 h时，其总黄酮、栀子苷含量综合评分结果不断升高，当达到1.5 h时最高，随着时间延长，综合评分结果逐渐下降，所以选择1.5 h为中心点。

2.5.2 加水量对总黄酮、栀子苷含量综合评分的影响 根据图2(B)可知，随着加水量的增加，综合评分结果不断升高，其当加水量为12倍时，综合评分结果最高，所以选择12倍时为最佳。

2.5.3 提取次数对总黄酮、栀子苷含量综合评分的影响 根据图2(C)可知，3～4次的综合评分为最佳，应考虑节约时间和溶剂用量，正交试验时，最终选择1、2、3次进行考察。

图2 单因素试验结果图

2.6正交试验设计

根据单因素试验结果，选择加水量(A)、煎煮时间(B)、煎煮次数(C)为考察因素，选用L9(34)正交试验设计表进行试验，因素水平见表2，提取液浓缩定容至25mL，以总黄酮、栀子苷含量及干膏率的综合评分为评价指标，对胆石六号颗粒的提取工艺条件进行分析，试验安排与结果见表3。

表2 胆石六号汤水提工艺正交试验因素水平

表3 胆石六号汤水提工艺正交试验安排及直观分析

注：综合评分=(Xi/Xmax×0.35×100+Yi/Ymax×0.45×100+Zi/Zmax×0.2×100)×100%。

表4 综合评分方差分析

注：F0.05(2，2)=19.0。

由直观分析可知，各因素影响胆石六号汤提取工艺顺序为C>A>B，方差分析结果表明，因素C对提取工艺有显著性影响，因素A、B则无显著性影响，确定最佳水提取工艺为A2B1C3，即加12倍量水，煎煮3次，每次1 h。

2.7验证试验

为进一步确定最佳提取工艺，对正交试验优选出来的提取工艺进行验证试验，称取与正交试验等量的药材，按优选的最佳水提取工艺进行3批验证试验，并测定提取液中总黄酮、栀子苷的含量和出膏率，结果见表5。该结果表明，优选出的工艺条件稳定、合理、可行。

表5 提取工艺验证结果

3 讨论

本方是由多味中药组成的一个复方制剂，成分复杂，长期以来临床以汤剂给药，为遵循中医传统用药的习惯和有效降低生产成本，实验采用水为溶媒进行提取，并采用单因素试验和正交试验设计优化其提取工艺。胆石六号汤由8味药材组成，黄酮类成分为该处方多味药材的有效成分，具有抗菌、消炎等活性；栀子为其处方药材中主要成分之一，具有抗炎、利胆、解热等作用。出膏率是水提工艺提取效率的传统指标，虽然不能反应有效成分的含量，但是可为后期制作颗粒剂提供参考依据，故选择总黄酮类、栀子苷含量及出膏率为评价指标，将总黄酮的权重系数设为0.45，栀子苷设为0.35，出膏率设为0.2，以加权综合评分作为筛选最佳工艺的依据，使结果更科学、合理。

本实验所选择的3个因素对提取工艺有不同的影响，其中提取次数影响有统计学意义。直观分析和方差分析结果表明，加水量为12倍，提取3次，每次1 h是制备胆石六号汤的最佳提取工艺。按最佳提取工艺条件进行3次验证试验，有效成分指标测定值较高，稳定性和重复性较好，可为胆石六号汤提取生产工艺的制定提供参考依据。

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OptimizationofExtractionProcessforGallstoneVIDecoctionbyOrthogonalTest

LIU Yan1，CHEN Ji1，HU Shanshan2，CHEN Zehui2，TIAN Yingbiao2*

(1.ZunyiMedicalCollege，GuizhouZunyi563003，China；2.AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege，GuizhouZunyi563003，China)

Objective：To optimize the extraction process of gallstone VI decoction.Methods：The comprehensive scores of total flavonoids，geniposide content and dry extract rate were used as indicators，the effect of amount of water，extraction time and frequency on gallstone VI of water extraction process were observed on the basis of single factor tests through L9 (34) orthogonal design.Results：The optimum process was determined as follows：adding 12 times of water and extracting 1h for 3 times.Conclusion：This optimized process is reasonable and feasible，which could guide industrial production.

Gallstone VI decoction；total flavonoids；geniposide；dry extract rate；orthogonal experiment

贵州省教育厅自然科学研究项目[黔教合K字(2012)054号]；贵州省科技计划课题[黔科合SY字(2015)3028号]；贵州省药剂学研究生卓越人才培养计划[黔教研合ZYRC字(2014)019]

] 田应彪，主任药师，研究方向：临床药学与新药研发;Tel：(0851)28608517，E-mail：tybczh@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.024

2016-08-13)

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