赵志敏黄 恺孙 鑫沈 丽刘成海，，3△

1.上海市中医临床重点实验室（上海，201203） 2.上海中医药大学附属曙光医院肝病研究所 3.上海高校中医内科学E-研究院

·实验研究·

基于肝窦内皮细胞损伤评价黄芪来源成分的防护作用*

赵志敏1黄 恺1孙 鑫2沈 丽2刘成海1，2，3△

1.上海市中医临床重点实验室（上海，201203） 2.上海中医药大学附属曙光医院肝病研究所 3.上海高校中医内科学E-研究院

目的：观察黄芪来源成分对氯化钴诱导SK-HEP-1细胞缺氧损伤的防护作用。方法：800μM氯化钴作用于SK-HEP-1细胞24小时，诱导细胞缺氧损伤，不同浓度的药物成分作用于SK-HEP-1细胞，MTT法检测细胞活力，免疫荧光染色检测细胞vWF表达，高内涵图像分析系统观察细胞膜通透性、细胞核形态及溶酶体变化，荧光探针法检测NO、NOS水平。结果：与正常组比较，模型组细胞活力显著下降，vWF表达明显增加，细胞溶酶体平均荧光强度明显减弱，NO、NOS水平显著下降（P＜0.05或P＜0.01）；药物处理后，细胞活力明显改善（P＜0.01），其中黄芪甲苷和黄芪皂苷Ⅱ组vWF表达显著下降，溶酶体和NO水平显著提高（P＜0.05）；毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮-7-O-b-D-葡萄糖苷组vWF表达、溶酶体显著改善（P＜0.05）；芒柄花素和芒柄花素-7-O-b-D-葡萄糖苷组细胞NO、NOS水平显著提高，芒柄花素组细胞溶酶体荧光显著增强（P＜0.05）。结论：黄芪来源的7种成分均有防护氯化钴诱导的SK-HEP-1细胞缺氧损伤的作用，但其作用基础存在细胞生物学差异。

黄芪来源成分；肝窦内皮细胞；缺氧损伤；防护作用

黄芪味甘、性微温，归脾、肺经，具有补气升阳，益气固表，托毒生肌，利水退肿的功效。黄芪及其提取物对肝纤维化具有良好的治疗作用［1，2］，其作用机制与改善肝脏血管损伤及肝窦毛细血管化有关［3］。肝窦内皮细胞（LSEC）是肝脏微血管的主要组成细胞之一，对缺血缺氧最为敏感。我们通过采用具有肝窦内皮细胞特征的SK-HEP-1细胞建立氯化钴诱导的缺氧损伤模型，进一步研究黄芪来源成分对改善肝窦内皮细胞缺氧损伤的防护作用，以期发现其活性成分。

1 材料与方法

1.1 药物及试剂 黄芪来源药物成分7种（黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮-7-O-b-D-葡萄糖苷、芒柄花素-7-O-b-D-葡萄糖苷、芒柄花素），购自上海融禾医药科技发展有限公司；六水合氯化钴（CoCl2·6H2O，Cat＃080M0101V）、噻唑蓝购自Sigma公司；MEM干粉（Cat＃41500-067）、胎牛血清（FBS，Cat＃10099）购自GIBCOTM公司；兔vWF多克隆抗体（ab6994）购自Abcam公司；细胞毒性2试剂盒（Cat＃8400101），购自ThermoFisher；DAF-FM DA［一氧化氮（NO）荧光探针，Cat＃S0019］、DAPI细胞核染色液、抗兔FITC荧光二抗（P0186）购自碧云天生物技术研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 SK-HEP-1细胞培养及化学缺氧损伤模型制备 SKHEP-1人内皮细胞购自ATCC，为人内皮来源的腹水瘤细胞，具备肝窦内皮的窗孔和内吞特性［4］，常规培养于含10%胎牛血清的MEM培养液。以每孔8000个细胞接种于96孔板，待细胞密度为70%左右，每孔加入100μl终浓度800μM的CoCl2·6H2O培养液，孵育24h诱导细胞损伤。

1.2.2 SK-HEP-1细胞分组与处理 每个药物单体成分均在160μM范围内设6个浓度梯度确定对SK-HEP-1细胞的最大无毒范围（与不加药组细胞比存活率＞90%），根据最大无毒浓度再分设3个浓度梯度分别作用于细胞模型。各药物与细胞共孵育24h同时添加800μM CoCl2·6H2O。

1.2.3 MTT法检测细胞活力 细胞接种于96孔板，长至亚单层，弃原培养液，换为各药物成分培养液，100μl/孔，每组4－6个复孔，孵育24h。弃药物培养液，加入0.5mg/ml MTT工作液，孵育4h。可见蓝紫色结晶，小心吸弃工作液，加入DMSO 100μl/孔，至充分溶解，在微孔板扫描分光光度计上测定吸光度OD490。

1.2.4 免疫荧光法检测细胞活力 4%多聚甲醛室温固定细胞15min，PBS洗涤，0.5%Triton X-100孵育10min，5%BSA/PBS 37℃封闭30mim，vWF一抗（1∶200）37℃孵育1h，PBS洗涤，荧光二抗（1∶100）37℃孵育1h，PBS洗后滴加DAPI染核5mim，PBS洗涤，Cellomics ArrayScan VTIHCSReader采集图像，Cellomics Cell Health Profiling BioApplication Software对图像进行分析。

1.2.5 细胞核形态、细胞膜通透性及溶酶体数量高内涵检测

亲核绿色荧光染料标记细胞膜，红色荧光染料标记溶酶体，4%甲醛室温固定15 min，PBS洗涤两次，DAPI标记细胞核，PBS洗涤两次，图像采集和分析同1.2.4。

1.2.6 荧光探针法检测一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）水平 药物孵育后弃原培养液，原位装载NO或NOS探针，100μl/孔。37℃细胞培养箱内孵育20～40min。PBS洗3次。Thermo scientific varioskan flash光谱扫描多功能读数仪上检测，使用495nm激发波长，515nm发射波长。

1.3 统计学方法 所有数据均使用SPSS 12.0软件包进行统计学分析，计量资料用±s表示。组间比较使用单因素方差分析，P＜0.05表示差异具有显著性意义。

2 结果

2.1 各药物成分对SK-HEP-1细胞氯化钴损伤模型细胞活力的影响

药物作用24小时各化合物对SK-HEP-1细胞最大无毒浓度分别为：黄芪甲苷20μM、黄芪皂苷Ⅰ10μM、黄芪皂苷Ⅱ5μM、毛蕊异黄酮20μM、毛蕊异黄酮-7-O-b-D-葡萄糖苷5μM、芒柄花素-7-O-b-D-葡萄糖苷10μM、芒柄花素5μM。造模后，模型组细胞活力较正常组显著下降（P＜0.01）；黄芪甲苷（5μM）、黄芪皂苷Ⅰ（2.5μM、5μM、10μM）、黄芪皂苷Ⅱ（1.25μM、2.5μM）、毛蕊异黄酮（5μM）、毛蕊异黄酮-7-O-b-D-葡萄糖苷（1.25μM、5μM）、芒柄花素（1.25μM）、芒柄花素-7-O-b-D-葡萄糖苷（2.5μM）组SK-HEP-1细胞活力明显提高（P＜0.01），见图1。

图1 各药物成分对SK-HEP-1细胞氯化钴损伤模型细胞活力的影响比较

2.2 各药物成分对SK-HEP-1细胞氯化钴损伤模型细胞vWF表达的影响

vWF免疫荧光染色显示，模型组细胞荧光强度较正常组显著升高（P＜0.05）；黄芪甲苷（10μM、20μM）、黄芪皂苷Ⅱ（2.5μM）、毛蕊异黄酮（5μM）、毛蕊异黄酮-7-O-b-D-葡萄糖苷（2.5μM、5μM）组vWF荧光强度有不同程度的降低（P＜0.05），差异具有显著性意义，见插页图2。

图2 各成分对SK-HEP-1细胞氯化钻损伤模型细胞vWF表达的影响图

2.3 各药物成分对SK-HEP-1细胞氯化钴损伤模型细胞核形态、细胞膜通透性及溶酶体的影响

高内涵检测结果显示，与正常组比较，模型组细胞核面积增大、平均荧光强度降低，细胞膜通透性增高，溶酶体平均荧光强度减弱（P＜0.05）；与模型组比较，各成分对细胞核形态及细胞膜通透性无明显影响（P＞0.05）；黄芪甲苷（5μM）、黄芪皂苷Ⅱ（5μM）、毛蕊异黄酮（5μM、10μM、20μM）、毛蕊异黄酮-7-O-b-D-葡萄糖苷（2.5μM、5μM）、芒柄花素（5μM）组细胞溶酶体平均荧光强度显著增强（P＜0.05），见插页图3。

图3 各成分对SK-HEP-1细胞氯化钻损伤模型细胞核形态、细胞膜通透性及溶酶体数量的影响图

2.4 各药物成分对SK-HEP-1细胞氯化钴损伤模型细胞NO、NOS的影响

NO、NOS荧光探针检测结果显示，模型组细胞NO、NOS表达较正常组明显降低（P＜0.01）；黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅱ、芒柄花素、芒柄花素-7-O-b-D-葡萄糖苷能够显著增加氯化钴损伤模型SK-HEP-1细胞NO、NOS的表达，差异具有显著性意义（P＜0.05或P＜0.01），见图4。

图4 各药物成分对SK-HEP-1细胞氯化钴损伤模型细胞NO、NOS的影响比较

3 讨论

肝脏受损和炎症时常伴有缺氧现象，肝窦内皮细胞是缺氧的感受器，其改变往往早于大部分慢性肝病的发展，任其进一步发展将加重肝脏疾病如纤维化并形成难以逆转的血管病理。缺氧损伤条件下，肝窦内皮细胞会发生表型变化，窗孔破坏、减少或消失，vWF表达增高；活性氧生成提高，细胞膜通透性增强，细胞核大小和形态发生改变，溶酶体膜的完整性受损，溶酶体内容物的释放甚至大于溶酶体的崩解引起细胞凋亡或坏死［5］。LSEC具有合成和分泌NO的功能，可通过NO-环磷鸟苷通路维持LSEC窗孔和表型，抑制星状细胞活化，从而调节肝窦和血管的舒张。实验证实肝硬化时LSEC功能紊乱，NO水平下降［6］。氯化钴化学诱导细胞缺氧损伤是体外研究常用的技术方法，广泛应用于神经细胞、癌细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞缺氧研究［7］。我们前期采用氯化钴诱导SK-HEP-1构建缺氧损伤模型，筛选并发现了部分抗肝窦内皮细胞缺氧损伤的中药活性成分［8］。在本实验中，SK-HEP-1细胞经氯化钴缺氧损伤处理后，表型标志物vWF表达增多，细胞膜通透性增强，溶酶体平均荧光强度显著下降，细胞核形态及大小出现改变，细胞活力显著下降。

黄芪是临床有效治疗肝纤维化的中药复方如当归补血汤、黄芪汤、复方861等方剂中的主要组成药味，其抗肝纤维化作用机制主要在于抗脂质过氧化、抑制星状细胞增殖、调节基质金属蛋白酶表达、抑制胶原合成和沉积等。黄芪及其提取物如黄芪总皂苷、黄芪总黄酮等多见于心脑血管疾病的研究，其有效成分可通过抑制细胞内皮素分泌、增加NO释放、维护细胞连接的完整性、抑制凋亡和促进增殖和迁移等保护内皮细胞功能［9］。对于肝窦内皮细胞这一特殊血管内皮的研究较少，李娟梅等发现黄芪多糖可通过影响肝窦内皮细胞微区力学、增加NO合成从而改善肝脏微循环［10］。本研究发现黄芪来源的7种单体成分对缺氧损伤的SK-HEP-1细胞活力有明显改善作用，其中皂苷类的黄芪甲苷和黄芪皂苷Ⅱ对抑制vWF表达、保护细胞溶酶体、改善细胞NO合成功能有明显作用；黄酮类的毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮-7-O-b-D-葡萄糖苷对vWF表达、细胞溶酶体有效，但对NO无明显影响；而同是黄酮类的芒柄花素和芒柄花素-7-O-b-D-葡萄糖苷对NO合成有明显改善作用，芒柄花素还可保护细胞溶酶体，但两者对细胞vWF表达无明显影响。综上所述，实验初步发现7种成分均有防护氯化钴诱导的SK-HEP-1细胞缺氧损伤的作用，但存在作用差异，对其机制的深入研究将对慢性肝病的治疗具有特殊意义。

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Evaluation the protective effects of the com pounds from astragalus based on liver sinusoid endothelial cell injury

ZHAO Zhi-Min1，HUANGKai1，SUN Xin2，LIUCheng-Hai1，2，3△，etal.1.Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine（Shanghai，201203）China

Objective：To observe the effects of the components from Astragalus on protecting SK-HEP-1 cells from hypoxia injury induced by cobaltous chloride（CoCl2）.M ethods：SK-HEP-1 cell hypoxia injury was induced by 800μM CoCl2 for24 hours，and the cellswere treated with different concentrations of components.Cell viability wasmeasured by MTT assay，vWF was detected by immunofluorescence staining，themembrane permeability，nuclearmorphology and lysosomal changeswere observed by high content screen（HCS）system，NO and NOSwere detected by fluorescence probemethod.Results：Compared with the control group，800μM CoCl2 decreased cell viability extremely，the expression of vWF increased significantly，themean fluorescence intensity of lysosomes，NO and NOSdecreased significantly（P＜0.05 orP＜0.01）.After treatment，cell viability was significantly improved in different groups（P＜0.01）.The expression of vWF was decreased while lysosomes and NO levels increased significantly in AstragalosideⅣand AstragalosideⅡgroups（P＜0.05）；in Calycosin and Genistein-7-O-b-D-glucoside groups，the expression of vWF was decreased but lysosome was improved significantly（P＜0.05）；NO and NOS levels in Formononetin and Ononin groups increased significantly，lysosomes in formononetin group were also significantly enhanced（P＜0.05）.Conclusion：The 7 compounds from astragalus have protective effects on SK-HEP-1 cells hypoxia injury induced by CoCl2，but there are some differences in cell biology.

sinusoidal endothelial cells；hypoxia injury；activity evaluation

2017－04－17 编辑：黄育华）

10.3969/j.issn.1005－0264.2017.03.011

国家自然科学基金（No.81473404）；中国博士后基金；△通讯作者：E-mail：chenghailiu＠hotmail.com