朱质斌 戴 炜王 东 张国良 聂 广

深圳市第三人民医院（广东 深圳，518112）

慢性丙型肝炎患者IL-28B基因多态性与中医证型及肝脏生化、APRI的相关性研究*

朱质斌 戴 炜Δ王 东 张国良 聂 广

深圳市第三人民医院（广东 深圳，518112）

目的：对慢性丙型病毒性肝炎的IL28B基因SNP进行分型，了解慢性丙型肝炎患者中IL28B不同等位基因的中医证候分布及其与肝脏生化、APRI评分的相关性。方法：采用焦磷酸测序方法对105例慢性丙型病毒性肝炎初治患者的IL28B基因rs12979860 SNP位点的基因型进行检测，完善其肝脏生化、血常规及B超检查，并对其行中医辨证分型，比较不同等位基因的中医证型分布及不同证型的肝脏生化情况、APRI评分。结果：105例慢性丙型肝炎患者的IL28B基因分型中CC型占90例，此分型中中医证型为肝肾阴虚者最多（37例，占41.1%），其AST及APRI评分比其他证型组明显升高，且其发生肝硬化的比例最高（P＜0.05）。结论：IL28B等位基因为CC的慢性丙肝患者中中医证型为肝肾阴虚的患者较其他证型患者肝脏生化异常最明显，APRI评分最高，提示肝肾阴虚组患者潜在发生肝硬化的风险更高。

慢性丙型肝炎；白细胞介素-28B；中医证型；生化指标

丙型肝炎主要经血液传播，其急性感染后慢性化率为55%～85%。宿主的一些遗传背景可能影响慢性化，IL-28B基因、人类白细胞抗原1类分子HLA B57等的等位基因多态性可影响HCV清除［1－3］。而HCV感染慢性化中医证型表现各异，均可导致肝纤维化及肝硬化，目前有关遗传背景及中医证型影响患者肝脏炎症活动的研究较少。我们前期研究发现宿主IL28B基因多态性（rs12979860：C/C、C/T、T/T）影响着HCV的自发清除和干扰素的治疗应答，本研究采用焦磷酸测序的方法对慢性丙型肝炎患者IL28B SNP-rs12979860位点进行基因型检测，探索慢性丙型肝炎患者IL-28B基因的多态性与中医证型及肝脏生化特点的关系，有助于今后开展针对慢性丙型肝炎的诊治。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取105例慢性丙型肝炎病例，均为在深圳市第三人民医院门诊或住院部治疗的患者，经雅培试剂检测HCVRNA病毒载量为阳性，其中男性60例，女性45例，平均年龄（49.6±13.0）岁。本研究经本院伦理委员会批准，所有入组研究对象均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂 全血DNA抽提试剂盒购自德国Qiagen公司，Ex Taq DNA聚合酶购自日本TAKARA公司，等位基因分型试剂购自美国ABI公司，紫外分光光度计购自美国Agilent公司产品，PCR仪购自为美国ABI公司，其它实验耗材购自Axygen公司。

1.3 实验方法

1.3.1 基因组DNA的提取、以及IL28B SNP的基因型检测

采集观察组患者血细胞，采用离心柱方法提取基因组DNA，以全自动凝胶成像分析仪检测DNA含量；在SNP上找到rs12979860序列，利用焦磷酸测序法对IL28B SNP-rs12979860位点进行基因型检测，以确定HCV患者的等位基因分型。

1.3.2 建立观察组患者证型演化的模型 观察组患者采用多元统计分析中的因子和聚类分析方法建立证型演化的模型。①制定慢性丙型肝炎患者中医四诊调查表：依据国家/行业标准、规范教材、专著、论文、古籍等文献中对慢性丙型肝炎患者肝纤维化的证候信息进行采集、整理、归纳，根据研究目的构建慢性丙型肝炎患者肝纤维化中医四诊调查表；经临床预调查，进一步修订完善后，形成正式四诊调查表，调查方式采用访谈式。②建立慢性丙型肝炎患者肝纤维化中医证候的模型，共分为5个中医证型，分别为肝肾阴虚证、肝郁脾虚证、脾肾阳虚证、湿热内阻证、淤血阻络证。

1.3.3 观察组患者血清HCV RNA载量、HCV基因型、肝脏生化指标如白蛋白（Alb）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）及血小板（PLT）的检测。对慢性丙肝患者，用实时荧光定量PCR方法进行HCV RNA定量检测；采用聚合酶链反应－微板核酸杂交－酶联免疫测定法进行HCV RNA基因分型检测；用全自动快速干式生化仪及专用试剂条（德国罗氏公司）进行肝脏生化指标检测，并计算患者APRI值。

1.4 实验结果判定 应用SPSS17.0处理数据，将患者的一般信息、中医四诊信息、检测指标等信息录入数据库。定量资料用均数表达，定性资料的频率用%表达。定量资料比较用t检验或非参数检验，定性资料比较用Pearsonχ2检验。中医证候与肝脏生化功能异常严重程度之间的关系用Correspondence analysis模块进行对应分析。用Pearsonχ2检验和Fisher精确检验进行基因型及等位基因频率进行单因素分析；用非条件Logistic回归进行多因素分析，调整各因素，计算相对危险度（Relative Risk，RR）及其95%可信区间（confidential interval，CI）。检验均为双侧检验，当P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 慢性丙型肝炎患者等位基因分型的分布及肝硬化的发生率情况，见表1。

慢性丙型肝炎患者不同IL28B等位基因分型的肝硬化病例数所占的比例有所不同。其中CC型患者的肝硬化发生率为53.3%（48/90），而CT型患者的肝硬化发生率为20%（3/15），由此可见，CC型患者发生肝硬化的比例比CT型明显要高（P＜0.05）。

表1 慢性丙型肝炎患者等位基因分型的分布及肝硬化的发生率比较 ［n（%）］

2.1 等位基因为CC型患者中不同中医证型的肝脏生化特点情况 见表2。

在IL28B等位基因分型的为CC型的患者中，根据慢性丙型肝炎中医四诊调查表，主要分5个中医证候型，其中肝肾阴虚组患者占比例最多，且其AST较其他4组升高，APRI值明显高于较其他4组，差异具统计意义（P＞0.05）。如表所示，肝肾阴虚组患者肝硬化比例最高，与其APRI值比其他证型明显升高结果一致，考虑与该证型患者长期肝功能异常、肝脏炎症反应明显，导致患者肝纤维化、肝硬化相关。

表2 等位基因为CC型患者中不同中医证型的肝脏生化特点（±s）

表2 等位基因为CC型患者中不同中医证型的肝脏生化特点（±s）

与其他四组比较，*P＜0.05

中医证型总例数（n，%）ALB（g/L）ALT（U/L）AST（U/L）（E＋9/L）APRI肝硬化发生数（例，%）PLT肝肾阴虚37（41.11）*40.69± 5.89*80.63± 50.61*82.50± 60.86**104.47± 47.01*3.01± 3.51**27（72.97）*肝郁脾虚17（58.60）脾肾阳虚29（32.2）42.56± 3.76 60.17± 22.04 71.48± 31.73 139± 50.26 2.01± 1.62 5（5.66）45.76± 1.09 71± 44.4 51± 9.2 140± 13.2 0.9± 0.08 0（0）湿热内阻16（17.78）43.82± 3.42 88.56± 75.70 77± 59.90 178.69± 44.6 1.52± 1.38 4（25%）淤血阻络3（3.33）38± 1 80± 1 40± 1 180± 1 0.56± 0.01 0（0）

3 讨论

在常用的SNP检测方法中，焦磷酸测序技术（pyrosequencing）是一种新型的酶联级联测序技术，其精确性及可重复性能与SangerDNA测序法相媲美，但速度明显的提高。焦磷酸测序技术对样品的快速测序分析能力，为大通量、低成本、快速地进行SNP研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台［4，5］。中国慢性丙型肝炎患者人群数量巨大，本研究应用焦磷酸测序技术对慢丙肝患者的IL28B基因SNP进行分型，大大提高了检测速度及研究结果的可靠性。

HCV感染进展多缓慢，感染后20年，儿童和年轻女性肝硬化发生率为2%～4%［6］。HCV相关HCC发生率在感染30年后为1%～3%，主要见于肝硬化和进展期肝纤维化患者，一旦发展成为肝硬化，HCC的年发生率为2%～4%［7］。肝硬化和HCC是慢性丙型肝炎患者的主要死因。肝硬化发生失代偿年发生率为3%～4%。一旦发生肝硬化，10年生存率约为80%，如出现失代偿，10年的生存率仅为25%。HCC在诊断后的第1年，死亡的可能性为33%［8］。

丙型肝炎肝损害的主要原因是HCV感染后引起的免疫学反应，其中细胞毒性T淋巴细胞（CTL）起重要作用［9］。丙型肝类患者的持续性的慢性炎症，是导致肝纤维化、肝硬化的重要基础，如能控制患者的肝脏慢性炎症，就可以减少患者的肝硬化、肝癌发生率。丙型肝炎慢性化机制还尚未完全阐明，有考虑与宿主免疫、遗传易感性和病毒等共同作用的相关。

我们通过对大量慢性丙型肝炎患者的长期随访，发现宿主感染HCV后个体差异很大，发病与否以及病情轻重程度均有差异，即使相同种族、性别及年龄相似的个体经同一种方式感染相同的病毒亚型，也可产生不同的后果，由此表明宿主遗传因素对疾病的发生、预后具有重要影响。本研究通过对慢性丙型肝炎患者IL-28B等位基因及其中医证型的分析，得出CC型患者中肝肾阴虚型患者所占比例最高，此证型患者的肝脏生化如AST异常最明显，差异具统计学意义。同时，此证型患者的APRI值最高，平均值达3.01，成人中如APRI评分大于2，预示患者已发生肝硬化［10］，与本研究中此证型患者的肝硬化发生率最高相符。由此研究得出，CC型慢性丙型肝炎患者中的肝肾阴虚型患者最多，而此证型患者的肝功能异常最明显，炎症反应显著，发生肝硬化的比例也最高，因此，且我们应该加强对此证型患者的监控，除抗病毒治疗外，可根据具体病情酌情行抗肝纤维化治疗，通过积极治疗，肝纤维化及早期肝硬化是可逆的。

由于本研究中慢性丙型肝炎患者的样本不多，尤其因种族特异性CT型患者样本量少，研究对象主要是中国的汉族南方人群，不能代表广泛性的丙肝疾病谱的特征。所以还存在一定的局限。在基因易感性方面还需加大样本量，采集不同地域的人群、不同年龄段、不同种族的人群进一步研究。我们将进一步收集更多的慢性丙型肝炎患者样本，对肝纤维化、早期肝硬化的慢性丙肝患者进行更深层次的探讨。

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Study on the correlation between the IL-28B gene polymorphism and Traditional Chinese M edicine syndrome，liver biochem ical characteristics and APRI in patients w ith chronic hepatitis C

ZHU Zhi－bin，DAIWeiΔ，WANG Dong，etal.The third people＇s Hospital of Shenzhen（Shenzhen Guangdong，518112）China

Objective：To study the correlation between the IL-28B gene polymorphism and Traditional Chinese Medicine syndrome，liver biochemical characteristics and APRI in patients with chronic hepatitis C.Methods：Pyrosequencingmethod was used to test genotype IL28B gene rs12979860 SNP and completed the liver biochemistry test，blood routine test，ultrasound examinatio in 105 cases of naive chronic HCVpatients visited our hospital.Then the TCM syndrome types were classified and the distribution of TCM Syndromes and their correlation with biochemical characteristics and APRI score were compared.Results：There were 90 cases CC type of IL28B gene in 105 chronic HCV patients visited our hospital.，the liver and kidney yin deficiency was themost common TCM syndrome in these patients（37 cases，41.1%），AST and APRIscore in this TCM syndrome were significantly higher than other syndromes，and the percentage of liver cirrhosiswas the highest in this syndrome.（P＜0.05）.Conclusion：The liver biochemical abnormalities and APRIscore aremostobvious in the liver and kidney Yin deficiency syndrome of IL28B allele for CC in patientswith chroinc HCV，so the patients in liver and kidney Yin deficiency syndrome has the higher potential risk to cirrhosis.

HCV；interleukin 28B；TCM syndrome；biochemical index

2017－03－16 编辑：肖明中）

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.03.008

深圳市科技创新项目（No.JCY20130401164750000）；Δ通信作者，Email：szdaiwei＠126.com