王春丽，张衡，李金华，陈志宝

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.中国科学院地质与地球物理研究所）

大庆黑鱼湖秋季趋磁细菌多样性分析

王春丽1，张衡1，李金华2，陈志宝1

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.中国科学院地质与地球物理研究所）

为研究大庆市黑鱼湖秋季沉积物中趋磁细菌的多样性，了解趋磁细菌分布。采用光学显微镜、透射电子显微镜（TEM）观察，扩增趋磁细菌16S rRNA基因的方法进行分析，结果发现，该区域趋磁细菌绝大多数为球菌。磁小体形状单一，皆为六面体棱柱，成分为Fe3O4，排列方式多样，分别为单链、散链和碎链。测序得到了30个趋磁细菌序列，分属7个OTU。系统发育分析结果表明,都属于α-变形菌纲。5个OTU与已知趋磁细菌序列的相似性等于95%,代表了趋磁细菌的5个新种。说明该区域存在可观的趋磁细菌资源。

黑鱼湖；趋磁细菌；多样性；16S rRNA基因；磁小体

趋磁细菌（magnetotactic bacteria）是一类沿着地球磁力线方向运动具有趋磁能力的革兰氏阴性细菌[1]。在细胞内可以矿化合成纳米级（35～120 nm）的磁小体，其主要成分是磁铁矿（Fe3O4）或胶黄铁矿（Fe3S4）[2]，广泛分布于淡水、海口和海洋等环境中[1]。趋磁细菌有许多形态类型，包括螺旋形、弧形、杆形、球形、卵球形和多细胞聚集体[3]。趋磁细菌系统发育分类属于变形菌门下的α-变形菌纲、©-变形菌纲、TM-变形菌纲、硝化螺旋菌门、Omnitrophica门（暂定分类单元OP3）和Latescibacteria门（暂定分类单元WS3）[4]。其中大部分趋磁细菌属于α-变形菌纲。趋磁细菌在20世纪中叶被人们发现[5]，德国学者最早对巴伐利亚地区基姆湖（Chiemsee）中的趋磁细菌群落进行了系统的研究[6]。此后,对趋磁细菌多样性的研究主要集中在美国、德国和日本等国[7]。趋磁细菌多样性研究工作在我国开展较晚[8]。对于大庆这种高纬度盐碱湿地湖泊的趋磁细菌多样性研究还未曾报道，趋磁细菌及其合成的磁小体在现代生物医学技术、工业发展、元素地球生物化学循环、纳米磁性技术和生物矿化等方面有重要的应用价值和研究意义[9]。因此，研究大庆地区趋磁细菌的多样性是十分必要的。

我们选取黑鱼湖作为研究地点，从形态多样性和系统发育多样性两方面对趋磁细菌的生物多样性进行研究，旨在了解黑鱼湖环境中趋磁细菌的多样性分布，进一步对大庆趋磁细菌的地理分布提供理论基础，促进对趋磁细菌资源及微生物矿化的认识，对未来趋磁细菌的种类、磁小体链数目差异和环境理化因子间作用关系提供依据。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料

黑鱼湖沉积物待检样品，DH5a感受态细胞购自北京天根生化公司，DreamTaq master mix、Thermolyne液氮罐购自美国Thermo公司，Gel Extraction Kit购自美国OMEGA bio-tek公司，载体试剂盒购自日本TaKaRa公司，PCR通用引物购自北京华大基因公司，BX-51荧光显微镜（OLYMPUS）购自日本，JEOL JEM2010透射电子显微镜（JEOL）购自日本，5452 Y微型高速离心机购自德国Eppendorf公司，FA1204B电子分析天平（雷磁）购自上海图新电子科技有限公司，SH-4C磁力搅拌器（JOAN LAB）购自宁波鄞州群安实验仪器有限公司，BSC-1300 IIB2超净工作台购自苏州安泰。

1.2 实验方法

1.2.1 沉积物样品的采集

2016年9月在大庆市黑鱼湖采集沉积物样品,利用实验室自制采样装置收集黑鱼湖表层沉积物，装到样品瓶中,每个样品瓶中约含泥样200～300 mL，水样100～200 mL，22℃暗处放置3周。

1.2.2 孔隙水pH测定

将沉积物样品1 000×g离心20 min，分离其中的孔隙水，测定pH。

1.2.3 趋磁细菌光学显微镜观察和磁收集

用塑料滴管从样品中取一滴，滴在盖玻片上，倒置放在载玻片的O型圈上，在载玻片左侧放一块小型条形磁铁，悬滴15 min左右。倒置显微镜观察，选出菌量适宜、状态较好的样品拍照记录，对这些样品进行标记，以备后续收集。

装有趋磁细菌沉积物样品的毛细管在外加磁场作用下放置1.5 h，将菌液转入1.5 mL离心管中备用。1.2.4透射电子显微镜观察

取1 μl菌液滴于铜网中心位置，放在25℃培养箱中干燥，将干燥好的铜网用无菌水清洗3～4次后继续干燥，铜网干燥后用JEOL JEM2010透射电子显微镜（中国科学院地球物理研究所电镜室）对样品中菌体与磁小体进行观察（包括趋磁细菌菌体形态和大小，磁小体形态、排列方式、大小及数目）。

1.2.5 趋磁细菌遗传多样性分析

1.2.5.1 PCR特异性扩增趋磁细菌的16S rRNA基因

聚合酶链式反应（PCR）采用细菌16S rRNA基因通用引物27f（5'-AGAGTYTGATCCTGGCTCAG-3'）与1392r（5'-ACGGGCGGTGTGTRC-3'）扩增，引物对应的扩增序列长度约1 364 bp，体系总体积为50 μl。反应条件为95℃预变性3 min；（95℃，1 min；50℃，1 min 30 s；72℃，1 min 30 s）共30个循环；最后72℃延伸10 min。利用浓度为0.1 g·L-1的琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，并用DNA回收试剂盒回收PCR产物。再将其与载体pMD19-T连接，用热激法转入大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α中，涂布到含有氨苄青霉素的Luria-Bertani平板上，构建趋磁细菌的16S rRNA基因克隆文库。

1.2.5.2 基因测序、序列比对、系统发育及多样性分析

随机选取样品中的菌落直接进行测序。利用软件去除序列中的质粒基因，在NCBI数据库进行序列比对，将序列按照相似性97%的标准划分分类操作单位OTU，选取每个OTU中具有代表性的序列利用MEGA软件进行ClastalW比对，切除不匹配序列，利用N-J法构建系统发育进化树。

2 结果

2.1 孔隙水pH值

大庆市黑鱼湖孔隙水pH值为8.05。

2.2 趋磁细菌的形态

透射电子显微镜（TEM）观察发现大庆市黑鱼湖趋磁细菌绝大多数为球形，但并不是规则球形，菌体大小为（1.20±0.22）μm×（0.95±0.15）μm，宽长比为0.78±0.09 μm。

2.3 磁小体的多样性与成分

通过透射电子显微镜（TEM）观察，发现大庆市黑鱼湖趋磁细菌的磁小体大小、个数存在差别，磁小体链排列方式多样。如图1所示，黑鱼湖趋磁细菌的磁小体有单链、散链以及碎链三种分布类型。磁小体均是六面体棱柱，成分为Fe3O4。每个趋磁细菌所含磁小体个数不等,一个趋磁细菌中磁小体最多可达25个，最少5个，平均每个趋磁细菌含有15个磁小体，其中单链的磁小体大小不一，可观察到两种直链。单链磁小体中最大的为148×122 nm，最小的为53×30 nm。散链中磁小体大小为（83±20 nm）×（49±20 nm），碎链中磁小体大小为（88±20 nm）×（46±20 nm）。

图1 透射电子显微镜下趋磁细菌的形态Fig.1Images showing the morphology of magnetotactic bacteria using transmission electron microscopy

2.4 趋磁细菌遗传多样性分析

2.4.1 趋磁细菌16S rRNA基因序列测定

对65个阳性克隆进行测序比对分析,其中属于趋磁细菌的序列有30条，分属7个OTU（相似性＜97%）,分别为clone H-1、clone H-2、clone H-3、clone H-4、clone H-5、clone H-6、clone H-7。其中有19条序列属于OTU（clone H-3）占总序列的63%。其中OTU（clone H-2）有3条序列占总序列的10%，其他OTU都是一条序列。

2.4.2 趋磁细菌16S rRNA系统发育分析及发育树构建

根据所得序列在NCBI数据库中Blast的比对结果，结合在BioEdit软件中进行比对得到的相似性，将得到的7个OTU序列与其相似性最高的序列以及已获得纯培养的趋磁细菌序列进行系统发育分析。

结果如表1显示，其中OTU（clone H-3）与数据库中clone OTU2和clone LM4相似度高达98%～99%，OTU（clone H-1）与clone XCQD4-20相似度95%，OTU（clone H-2）与clone7相似度95%，OTU（clone H-4）与clone OTU8相似度99%，OTU（clone H-5）与clone OTU2相似度95%，OTU（clone H-6）与clone TVG1-B7相似度95%，OTU（clone H-7）与clone 7相似度95%。

表1 GeneBank中与本实验所发现的OTU最相似的序列Table 1The most similar sequences in GenBank to OTUs this study discovered

在系统进化树上（如图2），7个OTU皆属于α-变形菌纲。根据Stackebrandt等[10]认为16S rRNA基因相似性大于97%属于一个种，小于93%～95%属于不同的属。对7个OTU相似性分析表明，其中有2个OTU（clone H-3、clone H-4）与已知最接近序列的相似性大于97%，可能是与相似序列是一个种；其中，有5个OTU（clone H-1、clone H-2、clone H-5、clone H-6、clone H-7）与已知最接近的序列的相似性等于95%，可能是5个新的种。

图2 趋磁细菌16S rRNA基因序列的遗传发育树（加粗的是本实验所获得的序列）Fig.2Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence analysis.（The sequences determined in this study are shown in bold）

3 讨论

黑鱼湖位于黑龙江省大庆市萨尔图区北30 km，松辽盆地成油区与北部林甸地热田的过渡地带，蕴藏着丰富的中低温地热资源[11]，是大庆地区比较著名的国家AAA景区，属于典型的湿地湖泊，存在特殊的湖泊环境，我们推测黑鱼湖可能有丰富的趋磁细菌资源。在多次富集的样品中，光学显微镜和透射电子显微镜观察α-变形菌纲趋磁球菌在秋季的黑鱼湖表层沉积物中占绝对优势,这一结果与之前研究结论：“无论是淡水还是海洋环境中，趋磁球菌都在数量上占优势”一致[12]。分子生物学16S rRNA基因序列分析结果显示黑鱼湖趋磁细菌具有较高的多样性。

与林巍等[12]昆明湖、元大都和密云水库进行的趋磁细菌多样性研究结果比较，昆明湖有5个OTU，与黑鱼湖序列比对相似度最高为95%，最低为84%。元大都1个OTU，相似度最高92%，最低为82%。密云水库分为16个OTU其中有13个OTU都是趋磁球菌，OTU相似度最高为94%，最低为79%，黑鱼湖与三个淡水湖泊序列相似度较低。昆明湖和元大都都是有着悠久历史的淡水湖泊，与黑鱼湖相比OTU稍少，可能是后期人工修缮时对湖泊的环境有所影响，黑鱼湖与这两个淡水湖相比有更加原始和古环境保护性较好的优势，这也可能是造成趋磁细菌多样性丰富的原因之一，并且黑鱼湖远离市区，人类活动影响小，元大都遗址位置在街区边，人类的长期活动也会影响趋磁细菌分布，造成趋磁细菌种类单一。黑鱼湖和密云水库构建发育树分析（图3），两个湖泊虽然都是淡水湖泊，但趋磁细菌群落构成差异较大，这可能受两个地区环境影响。第一，密云水库担负着向北京、天津两大城市供应工农业生产和生活用水的任务，水库的水质受国家保护[13]，黑鱼湖与密云水库都属于旅游风景区但是黑鱼湖属于碱性环境，水质也远不如密云水库。第二，黑鱼湖又名黑鱼泡，因盛产黑鱼而得名，而密云水库鱼类多为人工养殖，湖泊群落中不同的生物形成不同的食物链关系可能影响趋磁细菌群落分布。第三，季节因素同样影响趋磁细菌生存，Flies等[6]发现趋磁细菌的多样性随时间表现出动态变化，密云水库沉积物的采集时间是春季3、4月份，而黑鱼湖沉积物的采集时间是秋季9月份。趋磁细菌的生长、磁小体形态以及成分与外部生长环境有一定的关系[14-15]，黑鱼湖的高纬度和碱性环境可能是造成大庆黑鱼湖趋磁细菌发现新种的主要原因。

综上所述，秋季黑鱼湖趋磁细菌多样性研究为趋磁细菌数据库提供资源。复杂的环境和季节变化造成趋磁细菌群落差异，影响趋磁细菌多样性的微环境理化性质和生物因素有待于更全面的分析。

图3 黑鱼湖与密云水库趋磁细菌的系统发生树（加粗的是本实验所获得的序列）Fig.3Phylogenetic tree of magnetotactic bacteria in Lake HeiYu and Lake Miyun based on 16S rRNA gene sequence analysis（The sequences determined in this study is shown in bold）

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Analysis of Autumn Magnetotactic Bacteria Diversity in Heiyu Lake of Daqing City

Wang Chunli1，Zhang Heng1，Li Jinhua2，Chen Zhibao1
（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agriculture University，Daqing 163319；2.Institute of Geology and Geophysics，Chinese Academy of Sciences）

To investigate the diversity of magnetotactic bacteria in autumn sediment of Heiyu lake in Daqing and realize its distribution，the light microscope and transmission electron microscope（TEM）were utilized to observe magnetotactic bacteria，and it’s sequence was analyzed after 16S rRNA gene amplification.The results showed that most of the MTB were magnetotactic cocci and containing magnetosomes，which were hexahedral prismatic mineral crystals.All the magnetosomes were magnetite，most of which were organized in single，hash，and miscellaneous chain.Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences revealed that 30 sequences of MTB belonged to 7 OTUs and were affiliated to Alphaproteobacteria.Five OTUs shared equal to 95%16S rRNA gene sequence similarity with already known sequences，which suggested 5 new species.These results indicated the resourceful MTB of Heiyu lake.

Heiyu lake；Magnetotactic bacteria；diversity；16s rRNA gene；magnetosome

X172

A

1002-2090（2017）04-0082-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.018

2017-03-20

黑龙江八一农垦大学研究生科研创新资助项目（YJSCX2016-Y46）。

王春丽（1993-），女，黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院2015级硕士研究生。

陈志宝，男，教授，博士研究生导师，E-mail：chenzhibao@byau.edu.cn；李金华，男，副研究员，硕士研究生导师，E-mail：lijinhua@mail.iggcas.ac.cn。