孙记涛，阮长青，牛瑞，刘文静，张雪路，李芳，张爱武，张东杰

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

大米制品中乌洛托品总含量的检测

孙记涛，阮长青，牛瑞，刘文静，张雪路，李芳，张爱武，张东杰

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

为利用HPLC波长程序法检测大米制品中乌洛托品的总含量。以乙腈-乙酸铵溶液为流动相，经C18反相色谱柱分离，设定波长程序实现乌洛托品总含量的检测。结果表明乌洛托品在0.00～200.00 μg·mL-1，甲醛-2，4-二硝基苯腙在0.00～20.00 μg·mL-1浓度范围内；乌洛托品检出限为0.016 mg·kg-1；定量限为0.053 mg·kg-1；甲醛-2，4-二硝基苯腙检出限为0.026 mg·kg-1；定量限为0.087 mg·kg-1。样品加标回收率为84.84%～92.18%，相对标准偏差为1.70%～3.48%。

高效液相色谱；波长程序法；乌洛托品；甲醛-2，4-二硝基苯腙；米制品

乌洛托品，学名六亚甲基四胺（C6H12N4），在酸性条件下，能分解出甲醛和氨，甲醛易与人体内多种化学结构的受体发生反应，如与氨基化合物可以发生缩合，与巯基化合物加成，使蛋白质变性。甲醛在人体内还可还原为醇，故可表现出甲醇的毒理作用。对人体的肾、肝、中枢神经、免疫功能及消化系统等均有损害[1]。卫生部报道可能有些生产腐竹、米线的不法厂家违法使用乌洛托品以替代吊白块会起到增白、保鲜、增加口感和防腐的效果[2]，严禁使用于食品中。

目前检测乌洛托品的方法有很多，包括比色法[3]、电位滴定法[4]、电导滴定法[5]、分光光度法[6-7]、极谱法[8]、离子色谱法[9]、HPLC法[10-12]、GC法[13-16]、GC-MS法[17]和HPLC-MS法[18-23]。其中分光光度法具有仪器设备简单，易于进行的特点，但检测的干扰较大，灵敏度较低；GC-MS法和HPLC-MS法除了具备准确度高、线性好、检测限低，检测灵敏度高的优点，但仪器价格昂贵、检测成本高。HPLC法具有准确，线性好，回收率高的特点[24]，但灵敏度较前者低。目前HPLC法主要用于检测乌洛托品片剂本身，在食品中研究乌洛托品的检测方法较少。HPLC法在检测机构和企业中非常普遍，检测方法应用广泛。由于乌洛托品的检测存在样品中的分解问题，目前建立的方法均检测其残留量或甲醛的含量，并未检测其全部含量。针对以上问题建立了大米制品中乌洛托品总含量的检测方法，采用高效液相色谱波长程序法，对大米制品中未转化的乌洛托品和已转化的乌洛托品进行测定，已转化为甲醛的乌洛托品是通过2，4-二硝基苯肼衍生为甲醛-2，4-二硝基苯腙获得的。该法通过设定波长程序确保两种物质在最大吸收波长下进行同时检测，通过得到甲醛的含量来换算出已转化乌洛托品的含量，最终得到乌洛托品总含量。

1 材料与方法

1.1 材料

米线、米粉和年糕，来源于大庆市场。

1.2 仪器与试剂

Lab Alliance PC-2025型高效液相色谱仪附205/2000型可编程紫外可见检测器，（美国SSI/Lab Alliance公司），RE-5286A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），FW80型粉碎机（北京市永光明医疗仪器厂），PHS-3G型pH计（上海雷磁仪器厂），752N型紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），KQ-400KDE超声清洗器（昆山超声仪器有限公司），SHZ-C型水浴恒温振荡器（金坛市荣华仪器制造有限公司），HH-8恒温水浴锅（江苏金坛市环宇科学仪器厂），AR223CN型分析天平（美国奥豪斯仪器有限公司），TG16-WS台式高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司），AL-01型溶剂过滤系统（天津奥特赛恩斯仪器有限公司），针式微孔滤膜：0.22 μm，有机系（天津津腾实验设备有限公司），Synergy超纯水系统（MERCK MILLIPORE公司）。

乌洛托品（纯度≥99.5%，德国Dr.Ehrenstorfer公司），甲醛-2，4-二硝基苯腙（纯度≥99.5%，德国Dr. Ehrenstorfer公司），甲醇、乙醇、乙腈均为色谱纯（美国天地公司），三乙胺、无水乙酸铵、磷酸、甲酸均为优级纯，2，4-二硝基苯肼、冰醋酸、氢氧化钠、无水硫酸钠为分析纯，超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理方法

将粉碎后的样品混匀后，准确称取5.000 g于50 mL具塞离心管中，加入10 mL乙腈为提取溶剂，加入5 mL缓冲溶液（1 mol·L-1氢氧化钠和冰醋酸调节至pH=4.5），然后再加入亚铁氰化钾溶液（106 μg·mL-1）和乙酸锌溶液（220 μg·mL-1）各0.5 mL，用快速混匀器混匀，放于水浴振荡器上振荡后或放于超声波清洗器中超声提取30 min后，加入2，4-二硝基苯肼乙腈溶液（3.0 μg·mL-1）的衍生剂1 mL，混匀后60℃下衍生30 min，冷却，以4 000 r·min-1的速度离心15 min，将上清液倒入另外一个离心管中，再加入10 mL乙腈，混匀离心，取上清液合并，将上清液离心后，用塞有脱脂棉的漏斗中加入适量的无水硫酸钠过滤上清液于的旋转蒸发瓶中，旋转蒸发至近干，用流动相A定容至10 mL的容量瓶中，用0.22 μm的滤膜过滤，待上机测试。

1.3.2 测定条件

确定乌洛托品和甲醛-2，4-二硝基苯腙的最大吸收波长、色谱条件、优化流动相。在这些条件下对两种目标物定性，根据保留时间和检测波长确定波长程序。

1.3.2.1 检测波长

使用紫外可见分光光度计对浓度为10 μg·mL-1的标准物质在200～550 nm的波长范围下进行扫描，通过最大响应值确定其最大吸收波长。

1.3.2.2 色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS-C18色谱柱（4.6×250 mm，5 μm）；流动相A：乙腈：20 mmol·L-1乙酸铵溶液=20∶80；流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0.000～4.000 min（100%流动相A），4.000～12.000 min（50%流动相A+ 50%流动相B）；柱温：25℃；流速：1 mL·min-1；进样量：20 μL。

1.3.2.3 流动相选择

选取流动相为甲醇：水=75∶25[10，25]、甲醇∶水∶三乙胺∶磷酸=60∶40∶0.25∶0.075[12]甲醇：乙腈：0.1%磷酸溶液=40∶25∶35[26]、乙腈和20 mmol·L-1乙酸铵溶液不同比例为流动相等度洗脱，根据目标物的峰型与保留时间来确定合适的流动相。若等度洗脱效率低，则考虑梯度洗脱。

1.3.2.4 波长程序的设置

根据乌洛托品和甲醛-2，4-二硝基苯腙已确定好的最大吸收波长，分别在210 nm和350 nm。分别对乌洛托品和甲醛-2，4-二硝基苯腙的单一标准品进行定性分析，得到保留时间，顺序依次为乌洛托品和甲醛-2，4二硝基苯腙，通过保留时间来设定相对应的波长来进行检测，确保目标物在最大吸收波长下有最大的响应值。

1.3.3 乌洛托品总含量的确定及计算

1.3.3.1 乌洛托品优化方法及计算方法

乌洛托品在酸性条件下，能分解出甲醛和氨，甲醛与2，4-二硝基苯肼在酸性条件下生成甲醛-2，4-二硝基苯腙。加入100 μL乌洛托品标准溶液（1 000 μg·mL-1）的具塞离心管中，加入的缓冲溶液调节pH和2，4-二硝基苯肼乙腈溶液（3.0 μg·mL-1）1 mL，加入乙腈至10 mL，60℃加热30 min，直接进行HPLC分析。通过计算乌洛托品和甲醛-2，4-二硝基苯腙色谱峰的峰面积，来确定部分乌洛托品转化为甲醛的含量。直接测定得到的乌洛托品含量和转化为甲醛的部分乌洛托品含量的总和即为乌洛托品的总含量。

1.3.3.2 衍生的过程中的时间，温度及pH

采用某一条件为变量，固定其他条件进行试验。如固定（60℃水浴，衍生剂用量为1.0 mL，pH=4.8），进行了10、20、30、40、50 min的衍生反应时间的试验。如固定（反应时间为30 min，衍生剂用量为1.0 mL，pH=4.8），进行了30、40、50、60、70℃的衍生反应温度的试验。如固定（60℃水浴，反应时间为30 min，衍生剂用量为1.0 mL），进行了pH=2.50、3.50、4.50、5.50、6.50的衍生反应试验，按照1.3.3.1的衍生方法进行了试验，根据甲醛-2，4-二硝基苯腙的峰面积变化程度来确定合适的反应条件。

1.3.3.3 乌洛托品总含量的计算

试验采用外标法通过浓度和峰面积成正比的关系得到曲线方程，样品经进样得到峰面积通过曲线方程得到浓度，再利用浓度得到质量浓度，乘以稀释倍数得到含量。乌洛托品的总含量按公式（1）计算；转化为甲醛的乌洛托品含量按公式（2）计算。

m1—乌洛托品的总含量；m2—未转化的乌洛托品的量；m3—转化为甲醛的乌洛托品的含量；m4—甲醛-2，4-二硝基苯腙的量；F为甲醛与甲醛-2，4-二硝基苯腙的换算因子；k为甲醛转化为乌洛托品的系数为1/6。

1.3.3.4 甲醛含量与甲醛-2，4-二硝基苯腙含量的比值F因子的确定

利用已知浓度的甲醛标准品配制储备液，分别取100 μg·ml-1的甲醛储备液0.00、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00 mL（相当于0、1、2、4、8、10 μg甲醛）于10 mL具塞比色管中，加入5 mL缓冲溶液，用乙腈定容至刻度。经60℃水浴衍生化30 min处理后取20 μL进样。根据保留时间定性，峰面积定量，每个浓度重复做两次，取平均值，得到甲醛衍生后甲醛-2，4-二硝基苯腙的峰面积A1；配制相同浓度的甲醛-2，4-二硝基苯腙标准品溶液，同样得到峰面积A2。因此可以按公式（3）计算得到F因子：

1.4 方法评价

通过标准曲线外标法定量，检出限、定量限、精密度和准确度实验，对确定的好的样品前处理方法和测定条件进行方法验证[27]。

1.4.1 标准曲线

将乌洛托品和甲醛-2，4-二硝基苯腙用流动相A溶液配制浓度1 000 μg·mL-1的储备液，利用流动相A将储备稀释为浓度为0.00、10.00、20.00、40.00、80.00、100.00、200.00 μg·mL-1的乌洛托品和0.00、1.00、2.00、4.00、8.00、10.00、20.00 μg·mL-1甲醛-2，4-二硝基苯腙的混合标准使用液，进样，采用外标法通过峰面积和标样的浓度的线性关系建立标准曲线。样品进样后的峰面积与曲线比较定量，得到样品中目标物含量。

1.4.2 检出限与定量限

通过对阴性样品中逐级降低加标含量来确定检出限和定量限，以信噪比S/N=3对应的目标物浓度作为检出限，以信噪比S/N=10对应的目标物浓度作为定量限，得到乌洛托品和甲醛-2，4-二硝基苯腙的检出限和定量限。

1.4.3 精密度

同一操作者使用相同仪器设备、前处理方法和测定条件，在短时间内对相同的样品进行重复6次的加标回收率试验。以米线为样品，加标量为80.00 mg·kg-1，得到日内精密度。对100 μg·mL-1乌洛托品和10 μg·mL-1的混合标准品不同日期进行重复6次的测定，得到峰面积和保留时间的日间精密度。

1.4.4 准确度

对样品加入乌洛托品的标准物质使加标含量为10.00、40.00 mg·kg-1和80.00 mg·kg-1三个浓度进行回收率试验，每个样品进行6次平行试验，回收率验证方法的可行性。

1.4.5 数据处理

所有数据经过Microsoft Office Excel 2003进行偏差分析和图表的制作。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1 超声提取与振荡提取的对比

在室温和不同萃取时间下，以乙腈为提取溶剂，对米线进行加标回收率试验，加标量为40.00 mg·kg-1，对振荡提取和超声提取进行了比较。试验结果如表1所示。

表1 两种提取方式的回收率（n=6）Table 1The recoveries of two kinds of extraction method（n=6）

由表1可知，使用具塞离心管选择超声提取方式时，当30 min时回收率最高，提取效果最好，选择振荡提取方式时，当提取40 min是回收率最高，提取较好，超声提取的效果均好于振荡提取。因此试验选择超声提取，提取时间为30 min。

2.1.2 衍生的过程中的时间，温度及pH的选择

2.1.2.1 衍生时间的选择

选择60℃水浴，衍生剂用量为1.0 mL，pH=4.8为衍生条件，按照1.3.3.1的衍生方法进行了10、20、30、40、50 min的衍生反应时间的试验，根据甲醛-2，4-二硝基苯腙的峰面积变化程度来确定合适的衍生时间。试验结果如图1所示。

图1 衍生时间和峰面积的关系Fig.1The relationship between derivative time and peak area

由图1可知，随着衍生时间的增加，衍生物甲醛-2，4-二硝基苯腙的峰面积逐渐增加至30 min后趋于平稳，表明衍生反应充分。因此选择衍生时间为30 min。

2.1.2.2 衍生温度的选择

选择衍生反应时间为30 min，衍生剂用量为1.0 mL，pH=4.8为衍生条件，按照1.3.3.1的衍生方法进行了30、40、50、60、70℃的衍生温度的试验，根据甲醛-2，4-二硝基苯腙的峰面积变化程度来确定合适的衍生温度。试验结果如图2所示。

由图2可知，随着衍生温度的增加，衍生物甲醛-2，4-二硝基苯腙的峰面积逐渐增加至60℃后趋于平稳，表明衍生反应充分。因此选择衍生温度为60℃。

图2 衍生温度和峰面积的关系Fig.2The relationship between derivative temperature and peak area

2.1.2.3 衍生过程中pH的选择

选择60℃水浴，反应时间为30 min，衍生剂用量为1.0 mL为衍生条件，使用1.0 mol·L-1氢氧化钠溶液和冰醋酸进行调节缓冲溶液的pH，在2.50、3.50、4.50、5.50、6.50的pH下按照1.3.3.1的衍生方法进行反应试验，根据甲醛-2，4-二硝基苯腙的峰面积变化程度来确定衍生过程中的pH。试验结果如图3所示。

图3 衍生过程中pH和峰面积的关系Fig.3The relationship between pH and peak area in the process of derivatives

由图3可知，随着衍生过程中pH的增大，衍生物甲醛-2，4-二硝基苯腙的峰面积逐渐增加后又逐渐减少，当pH=4.50时衍生物的峰面积最大，表明衍生反应效果最好。

2.2 测定条件的确定

2.2.1 检测波长

根据参考文献设定乌洛托品的检测波长为210 nm[10，12，25]。对甲醛-2，4-二硝基苯腙使用紫外可见分光光度计在适当波长范围内进行扫描，得到其最大吸收波长。

图4 甲醛-2，4-二硝基苯腙的波长与吸光度的关系Fig.4The relationship between wavelength and absorbance of formaldehyde-2，4-dinitrobenzene hydrazone

由图4可知，甲醛-2，4-二硝基苯腙的最大吸收波长为350 nm。在对应的波长下有最大响应值，干扰物响应值小[28]。

2.2.2 流动相的选择

选取流动相为甲醇：水=75∶25、甲醇∶水∶三乙胺∶磷酸=60∶40∶0.25∶0.075甲醇：乙腈：0.1%磷酸溶液= 40∶25∶35、乙腈：20 mmol·L-1乙酸铵溶液不同比例进行等度洗脱。选择乌洛托品（100 μg·mL-1）和甲醛-2，4-二硝基苯腙（10 μg·mL-1）混合标准品进样各流动相的色谱图如图5至8所示。

图5 流动相为甲醇：水=75∶25时标准品的色谱图Fig.5The standard chromatogram of mobile phase methanol∶water=75∶25

图6 流动相为甲醇∶水∶三乙胺∶磷酸=60∶40∶0.25∶0.075时标准品的色谱图Fig.6The standard chromatogram of mobile phase methanol∶water∶triethylamine∶phosphoric acid=60∶40∶0.25∶0.075

图7 流动相为甲醇∶乙腈∶1%磷酸铵=40∶25∶35时标准品的色谱图Fig.7The standard chromatogram of mobile phase imethanol∶acetonitrile∶1%ammonium phosphate=40∶25∶35

图8 流动相为乙腈：20 mmol·L-1乙酸铵=20：80时标准品的色谱图Fig.8The standard chromatogram of mobile phase acetonitrile：ammonium acetate of 20 mmol·L-1

由图5至图7可知，混合标准品进样后乌洛托品的峰型不好，由于甲醇在做流动相时210 nm处有吸收，对乌洛托品有干扰，因此有机相选择乙腈。由图8可知，乌洛托品在流动相乙腈∶20 mmol·L-1乙酸铵溶液=20∶80峰型较好，经过试验得出甲醛-2，4-二硝基苯腙在流动相乙腈∶20 mmol·L-1乙酸铵溶液= 20∶80保留时间延后至44.521 min。甲醛-2，4-二硝基苯腙在乙腈∶20 mmol·L-1乙酸铵溶液=60∶40的保留时间可以提前至9.445 min可以有效节省检测时间。因此采用梯度洗脱程序流动相A：乙腈∶20 mmol·L-1乙酸铵溶液=20∶80；流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0.000～4.000 min（100%流动相A），4.000～12.000 min（50%流动相A+50%流动相B），可以缩短保留时间和改善峰型。

2.2.3 波长程序的设置

根据乌洛托品和甲醛-2，4-二硝基苯腙已确定好的最大吸收波长，分别在210 nm和350 nm。分别对乌洛托品和甲醛-2，4-二硝基苯腙的单一标准品进行定性分析，得到保留时间，顺序依次为乌洛托品t=2.663 min和甲醛-2，4-二硝基苯腙t=9.485 min，通过保留时间来设定相对应的波长来进行检测，确保目标物在最大吸收波长下有最大的响应值。波长程序为0.000～4.000 min（乌洛托品，210 nm），4.000～12.000 min（甲醛-2，4-二硝基苯腙，350 nm）。

2.2.4 甲醛含量与甲醛-2，4-二硝基苯腙含量的比值F的确定

乌洛托品转化为甲醛后，甲醛与2，4-二硝基苯肼衍生为甲醛-2，4-二硝基苯腙，要明确甲醛衍生的量，按照公式（3-4）计算确定二者的转化比值F。试验结果见表2所示。确定F的平均值为0.133 8[29]。

表2 甲醛衍生后峰面积与甲醛-2，4-二硝基苯腙峰面积的比值FTable 2The ratio F of formaldehyde derivative peak area to formaldehyde-2，4-dinitrobenzene hydrazone peak area

2.3 方法评价

2.3.1 标准曲线及检出限

标准曲线、检出限及定量限试验结果见表3，乌洛托品在0～200.00 μg·mL-1的浓度范围内线性关系良好，甲醛-2，4-二硝基苯腙在0～20.00 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好，相关系数R2≥0.999 8；乌洛托品检出限为0.016 mg·kg-1；定量限为0.053 mg·kg-1；甲醛-2，4-二硝基苯腙检出限为0.026 mg·kg-1；定量限为0.087 mg·kg-1。

表3 标准曲线、检出限及定量限Table 3The standard curve，detection limit and quantitation limit

2.3.2 精密度

试验对方法和仪器进行了精密度评价，日内精密度测定结果如表4所示，图9为米线加标量为80.00 mg·kg-1的色谱图。仪器精密度如表5所示。图10为100 μg·mL-1乌洛托品和10 μg·mL-1甲醛-2，4-二硝基苯腙的混合标准品色谱图。

由表4可知，同一操作者使用相同的仪器和相同的前处理方法，连续测定6次，得到的方法精密度，RSD为2.47%，方法重现性良好。

由表5可知，对100 μg·mL-1乌洛托品和10 μg·mL-1甲醛-2，4-二硝基苯腙的混合标准品进行重复6次的测定，得到峰面积的RSD范围在1.15%～1.72%之间和保留时间的RSD范围在0.81%～1.16%之间，重现性良好，仪器稳定，可行性得到验证。

2.3.3 准确度

所选的米线、米粉、年糕样品均未检出乌洛托品及甲醛，因此空白值可以不计。对一个样品同时加入乌洛托品的标准物质使三个浓度进行回收率实验，每个样品进行6次平行实验，测定结果如下表6所示。

图9 米线加标量为80 mg·kg-1的色谱图Fig.9The chromatograms of rice noodle with 80 mg·kg-1added standard amount

图10 乌洛托品（100 μg·mL-1）和甲醛-2，4-二硝基苯腙（10 μg·mL-1）混合标准品的色谱图Fig.10The mixed standard chromatogram of methenamine（100 μg·mL-1）and formaldehyde-2，4-dinitrobenzene hydrazone（10 μg·mL-1）

表4 样品连续测定结果Table 4The results of continuous determination of the sample

表5 混合标准品峰面积和保留时间的精密度（n=6）Table 5RSD of Peak area and retention time of mixed standard（n=6）

表6 样品加标回收率测定结果（n=6）Table 6The recovery rate of standard addition in sample（n=6）

由表6可知，样品平均回收率在84.84%～92.18%之间，RSD范围在1.70%～3.48%之间，回收率试验结果满足有机残留物和污染物关于加标回收率及其相对标准偏差的要求[30]。

3 结论

建立了大米制品中乌洛托品总含量的检测方法，采用高效液相色谱法，通过设置波长程序同时检测未转化的乌洛托品和甲醛-2，4-二硝基苯腙（甲醛衍生物）实现同时检测得到乌洛托品总含量。方法标准曲线线性关系良好，检出限、定量限、准确度和精密度均满足检测需要。采用的高效液相色谱仪在实验室较普遍适用范围广、仪器成本较低、缩短检测时间，提高检测效率，减少日常分析中仪器的损耗并节约试验试剂等经济性特点，对大米制品及其他食品中乌洛托品的测定有参考价值。

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Detection of the Total Amount of Methenamine in Rice Products

Sun Jitao，Ruan Changqing，Niu Rui，Liu Wenjing，Zhang Xuelu，Li Fang，Zhang Aiwu，Zhang Dongjie
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

The detection of the total content of methenamine in rice products was established by using HPLC wavelength program method.Sample solutions were extracted under ultrasonic condition with acetonitrile，and centrifuged，the supernatant was concentrated by rotary evaporator.The aqueous solution of acetonitrile-ammonium acetate was added to the mobile phase and carried on C18 column，then the programmed wavelength ultraviolet detection was performed to determine the total content of methenamine. The results showed that the concentration range was 0.00-200.00 μg·mL-1and 0.00-20.00 μg·mL-1for methenamine and formaldehyde-2，4-dinitrobenzene hydrazone，respectively.The detection limit of methenamine was 0.016 mg·kg-1，the quantitation limit was 0.053 mg·kg-1.The detection limit of formaldehyde-2，4-dinitrobenzene hydrazone was 0.026 mg·kg-1，the quantitation limit was 0.087 mg·kg-1.The recoveries range of sample added standards was 84.84%-92.18%with RSD of 1.70%-3.48%.

HPLC；wavelength program method；methenamine；Formaldehyde-2，4-dinitrobenzene hydrazone；rice products

TS207.3

A

1002-2090（2017）04-0054-08

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.013

2016-04-20

黑龙江省研究生创新科研项目（YJS（X2015-Y51）；黑龙江省高校“农产品加工与质量安全”创新团队项目（2014TD006）。

孙记涛（1987-），男，助理工程师，黑龙江八一农垦大学毕业，现主要从事食品营养与安全方面的研究。

阮长青，男，教授，硕士研究生导师，E-mail：cqruan@163.com。