易 辉，祖瑞铃，易玉玲，李 燕

(成都中医药大学医学技术学院，成都 611137)

隐丹参酮对表皮葡萄球菌生物膜的抑制作用

易 辉，祖瑞铃，易玉玲，李 燕

(成都中医药大学医学技术学院，成都 611137)

目的探索隐丹参酮对表皮葡萄球菌(SE)生物膜不同成熟阶段的抑制效果。方法体外构建SE生物膜模型，确定其黏附、聚集、成熟阶段时间点；通过半定量黏附实验、XTT法和扫描电镜检测不同浓度隐丹参酮作用下SE不同成熟阶段中生物膜基质量、膜内菌代谢活性和微观形态结构的变化。结果SE生物膜黏附、聚集和成熟时间点分别为6、24、48 h；对于黏附阶段生物膜，128 μg/mL和32 μg/mL的隐丹参酮均能明显减少其生物膜基质量和杀灭膜内菌，差异有统计学意义(P<0.05)，且隐丹参酮抑制作用128 μg/mL优于32 μg/mL，差异有统计学意义(P<0.05)，同时均能破坏其微观形态结构；对于聚集与成熟阶段生物膜，仅128 μg/mL的隐丹参酮能明显减少其生物膜基质量和杀灭膜内菌，差异有统计学意义(P<0.05)，同时能破坏其微观形态结构，而32 μg/mL的隐丹参酮则无明显抑制效果(P>0.05)。结论隐丹参酮对SE生物膜不同成熟阶段均具有一定抑制效果，且存在一定的剂量效应。

表皮葡萄球菌； 生物膜； 隐丹参酮

[Chin J Infect Control，2017，16(9)：798-803]

近年，高分子材料制成的医疗植入物的广泛应用，如导管、人工心瓣膜、人工关节等，表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis，SE)所致感染日趋严重，已位于医院感染病原体的第四位。研究[1]表明，细菌黏附于医疗植入物表面形成生物膜是该菌致病、难以治愈、容易复发的主要原因。目前，临床多采用大剂量的抗菌药物治疗此类感染，造成该菌耐药性加剧，相对而言，中药不易造成细菌耐药，在新药研发中具有一定的优势。丹参作为川产道地药材，临床常用功效为祛瘀止痛、活血通经、清心除烦，其有效成分分为脂溶性的丹参酮和水溶性的丹酚酸两大类，其中丹参酮类化合物(即总丹参酮)还具有抗菌、抗炎作用，但研究和临床应用较少。已有研究[2]发现，丹参根甲醇提取物对SE、金黄色葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌等浮游菌表现出较强的抑菌活性，且价格低廉，具有进一步开发应用潜力。目前，国内外尚未见丹参酮抑制细菌生物膜形成的相关报道，本课题组的前期研究中，通过测定总丹参酮及其主要单体成分丹参酮I、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ对SE的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最小生物膜抑菌浓度(minimum biofilm inhibitory concentration，MBIC)，发现隐丹参酮为丹参酮类化合物中对SE抑菌活性最强的单体成分，故本研究选用隐丹参酮作为靶药，以万古霉素为阳性对照药物，观察不同浓度药物作用下SE生物膜形成过程不同阶段基质量、膜内菌代谢活性和微观形态结构的变化，探索不同浓度隐丹参酮对SE生物膜不同成熟阶段的抑制效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 表皮葡萄球菌1457(生物膜阳性株)和表皮葡萄球菌ATCC 12228(生物膜阴性株)，均由复旦大学瞿涤教授惠赠；临床菌株：本实验室从成都地区两所医院收集、鉴定、保存的5株临床生物膜阳性菌株[3-4]。

1.1.2 主要试剂与仪器 包括隐丹参酮对照品(成都普菲德生物公司)、万古霉素标准品(中国食品药品检定研究院)、XTT试剂(南京凯基生物科技公司)、无菌96孔板和6孔板(美国Costar公司)、酶标仪(Nanodrop 2000)、扫描电镜(日立 1000B)。

1.2 方法

1.2.1 SE黏附、聚集、成熟阶段生物膜的建立 参照文献[5-6]方法略做改动：SE接种至TSB培养基37℃过夜培养，调节菌液浓度至1×106CFU/mL，200 μL/孔加至96孔板中，分别于37℃ 0、3、6、12、24、36、48、72、96 h结束培养，无菌PBS漂洗3次；2.5%戊二醛固定30 min，弃去孔内液体；0.1%结晶紫染液染色5～15 min，自来水冲洗未黏附染料，室温晾干；加入95%乙醇微振荡，酶标仪检测A570值，绘制生物膜基质生长曲线。

1.2.2 药物处理 SE接种至TSB中37℃过夜培养，调节菌液浓度至1×106CFU/mL，200 μL/孔加至96孔板中37℃培养，分别于1.2.1确立的时间点结束培养，无菌PBS漂洗3次，200 μL/孔加入以下实验分组(见表1)的药液，37 ℃培养24 h。

表1生物膜形成阶段和实验分组情况

Table1Biofilm formation periods and experimental groups

生物膜形成阶段及实验分组干预药物 药物终浓度(μg/mL)6h(黏附) A1不加药对照0 A2万古霉素32 A3高浓度隐丹参酮128 A4低浓度隐丹参酮3224h(聚集) B1不加药对照0 B2万古霉素32 B3高浓度隐丹参酮128 B4低浓度隐丹参酮3248h(成熟) C1不加药对照0 C2万古霉素32 C3高浓度隐丹参酮128 C4低浓度隐丹参酮32

1.2.3 半定量黏附实验检测SE生物膜基质的变化 参照文献[7]方法略做改动：按照1.2.2中方法处理后，无菌PBS漂洗3次，戊二醛固定30 min，结晶紫染液染色5～15 min，自来水冲洗，室温晾干，加入95%乙醇微振荡，检测A570值。

1.2.4 XTT法检测SE生物膜内细菌代谢活性变化 参照文献[8-9]方法略做改动：按照1.2.2中方法处理后，无菌PBS漂洗3次，加入 100 μL MH培养基和50 μL XTT工作液，37℃避光培养1～4 h，酶标仪检测A450值。

1.2.5 扫描电镜观察SE生物膜微观形态变化 按文献[10]方法略做改动：调节SE菌液浓度至1×106CFU/ mL，3 mL/孔加入到无菌6孔板中，每孔加入一片无菌玻片，分别于37℃ 6、24、48 h结束培养，取出玻片用无菌PBS漂洗3次，然后放入新的无菌6孔板中，3 mL/孔加入表1中实验分组的药液，37℃培养24 h，取出玻片用无菌PBS漂洗3次，戊二醛4℃固定2 h，无菌PBS漂洗，依次用浓度为30%、50%、70%、70%、80%、90%、100%的乙醇，4℃梯度脱水10 min，叔丁醇置换及真空干燥后喷金进行扫描电镜观察拍照(10 000×，10 μm视野)。

2 结果

2.1 SE生物膜生长曲线及黏附、聚集和成熟时间点确立 SE生物膜生长有3个增长期，分别是0～12 h、12～36 h和36～72 h，其中0～12 h增长最快，对应生物膜黏附期，此时浮游SE正不断黏附到聚丙乙烯微孔板上；12～36 h增长第二快，对应生物膜聚集期，此时已经黏附于聚丙乙烯微孔板上的SE相互聚集并合成分泌大量胞外基质逐渐形成微菌落，同时生物膜也逐渐走向成熟；36～72 h生物膜基质量增长缓慢，对应生物膜成熟期，此时主要是已形成的微菌落之间相互融合生长，发育成具有蘑菇状结构的成熟生物膜。因此，本实验分别选择各阶段中间时间点6、24、48 h作为SE生物膜的黏附、聚集和成熟点进行药物干预。见图1。表皮葡萄球菌 ATCC 12228为生物膜形成阴性株，不能在聚丙乙烯微孔板上形成生物膜，故其黏附于微孔板上的细菌量基本保持不变。

图1 SE生物膜生长曲线

2.2 药物作用下SE生物膜基质的变化 SE不同阶段生物膜基质量的变化见图2。

图2SE生物膜基质量的变化

Figure2Change in quantity ofS.epidermidisbiofilm matrix

黏附阶段：与不加药对照组相比，32 μg/mL万古霉素组、128 μg/mL隐丹参酮组和32 μg/mL隐丹参酮组生物膜基质量均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；但128 μg/mL和32 μg/mL隐丹参酮组的抑制作用均不及32 μg/mL万古霉素组，差异有统计学意义(P<0.05)；32 μg/mL隐丹参酮组又不及128 μg/mL隐丹参酮组，差异有统计学意义(P<0.05)。

聚集阶段：与不加药对照组相比，32 μg/mL万古霉素组和128 μg/mL隐丹参酮组生物膜基质量均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，而32 μg/mL隐丹参酮组则无降低。

成熟阶段：与不加药对照组相比，仅128 μg/mL隐丹参酮组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，32 μg/mL万古霉素组和32 μg/mL隐丹参酮组的降低无统计学意义(均P>0.05)。

2.3 药物作用下SE生物膜内细菌代谢活性变化 SE不同阶段生物膜膜内菌代谢活性变化见图3。黏附和聚集阶段呈现结果一致：与不加药对照组相比，32 μg/mL万古霉素组、128 μg/mL隐丹参酮组和32 μg/mL隐丹参酮组生物膜膜内菌代谢活性均明显降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)；但 128 μg/mL和32 μg/mL隐丹参酮组的抑制作用均不及32 μg/mL万古霉素组，差异有统计学意义(P<0.05)；32 μg/mL隐丹参酮组又不及128 μg/mL隐丹参酮组，差异有统计学意义(P<0.05)。成熟阶段：与不加药对照组相比，仅32 μg/mL万古霉素组和128 μg/mL隐丹参酮组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，而32 μg/mL隐丹参酮组则无明显降低。

图3SE生物膜内细菌代谢活性变化

Figure3Change in metabolism ofS.epidermidisinside biofilm

2.4 药物作用下SE生物膜微观形态变化 扫描电镜下SE不同阶段生物膜微观形态见图4。黏附阶段：不加药对照组生物膜形态结构完整，而万古霉素组、高浓度和低浓度隐丹参酮组生物膜结构均被破坏瓦解。聚集和成熟阶段：呈现相似的抑制效果，不加药对照组生物膜结构复杂完整，膜内细菌形态正常，SE分泌了大量胞外基质将细菌包裹于生物膜之中，而低浓度隐丹参酮组生物膜结构无明显变化，万古霉素组和高浓度隐丹参酮组生物膜结构虽然存在，但是膜结构远远不如不加药对照组完整紧密，且膜厚度明显减低，膜内细胞可见变形、皱缩、或死亡。

注：A1、B1、C1分别为黏附、聚集、成熟阶段不加药对照组；A2、B2、C2分别为黏附、聚集、成熟阶段32 μg/mL万古霉素作用组；A3、B3、C3分别为黏附、聚集、成熟阶段128 μg/mL隐丹参酮作用组；A4、B4、C4分别为黏附、聚集、成熟阶段32 μg/mL隐丹参酮作用组

图4扫描电镜下SE生物膜微观形态(10 000×，10 μm)

Figure4Change in microstructure ofS.epidermidisbiofilm observed by SEM(10 000×，10 μm)

3 讨论

一直以来，中药在控制细菌感染及多重耐药性方面具有独特的优势，已成为继抗生素之后又一抗感染药物研究的重点。近年来，国内外学者研究发现中药或中药活性成分在抑制细菌生物膜方面显现了一定的优势，Zeng等[11]发现穿心莲内酯能够抑制铜绿假单胞菌生物膜胞外基质的形成，并与多种抗菌药物联用表现出协同抗菌效果；Pammi等[12]发现，金合欢醇能够抑制SE生物膜形成，并与利福平和万古霉素显现出协同抗菌作用。丹参作为常用的天然药物，临床主要用于治疗心脑血管疾病，对其活血化淤、清心除烦的药理药效研究较多，而对丹参的抗炎、抗菌作用研究和临床应用较少。丹参的脂溶性提取物(丹参酮类化合物)作为丹参发挥抗菌作用的最主要物质基础，对大多数细菌表现出抑制作用，特别是对葡萄球菌属细菌等革兰阳性菌[13-14]。Lee等[13]测定了隐丹参酮和二氢丹参酮Ⅰ对多种革兰阳性菌和阴性菌的MIC值，发现二者对SE抑菌效果好，MIC分别为6.3 μg/mL和3.1 μg/mL；Feng等[15]采用隐丹参酮对临床21株金黄色葡萄球菌进行抑菌试验，得到隐丹参酮对21株菌的MIC为4～64 μg/mL，具有较好的抑菌效果。尽管已有隐丹参酮抑制细菌浮游菌生长的相关报道，但目前尚未见其抑制细菌生物膜形成的报道。故本研究选择隐丹参酮为靶药，观察隐丹参酮对SE生物膜不同成熟阶段的抑制效果，为丹参酮用于预防和治疗生物膜耐药SE感染的可能性提供实验依据。

生物膜是依附于某载体表面的，由胞外多聚物和基质包被的高度组织化、系统化的微生物膜性聚合物，其临床意义为不断释放膜内细菌造成感染迁延不愈。对于生物膜状态的致病菌，根据临床传统的抗菌药物敏感性试验所得到的抗菌药物治疗浓度已经完全不能控制此类感染。已有大量证据表明，杀死生物膜内细菌所用的抗生素浓度是杀死浮游菌所用抗生素浓度的10～1 000倍，因此，目前美国传染病协会提出了抗生素锁定技术(antibiotic lock technique，ALT)用于治疗生物膜引起的医疗植入物相关感染[16]。基于ALT的提出，目前许多研究者通过在体外建立生物膜模型，然后使用10～1 000倍MIC的抗菌药物作用于生物膜，观察药物清除生物膜所需的浓度及时间，以便更加准确地为临床指导用药。如Lee等[17]依据ALT，发现5 mg/mL的万古霉素、5 mg/mL的环丙沙星和5 mg/mL的利福平能够在5 d内清除SE生物膜。根据本课题组前期实验中用二倍稀释法测得隐丹参酮对SE的MIC为2 μg/mL，MBIC为32 μg/mL，故本研究选择的低浓度隐丹参酮作用浓度为32 μg/mL(16倍MIC)，高浓度隐丹参酮为128 μg/mL(64倍MIC)，观察药物作用生物膜的剂量效应。同时，通过建立SE生物膜生长曲线，以确定细菌黏附、聚集和成熟各个阶段时间点，在不同时间点给予药物干预，从而更加全面、深入地探讨药物对其抑制效果。由于万古霉素是临床治疗葡萄球菌感染的最后一道防线，故本研究选择其为阳性对照药物。

本研究首次证明了隐丹参酮一定程度上能够抑制SE生物膜各个阶段基质形成、膜内菌代谢活性、破坏生物膜整体微观形态，且此抑制作用存在一定的剂量效应。随着生物膜成熟度的增高，高浓度的隐丹参酮抑制作用强于低浓度的隐丹参酮，甚至对于成熟生物膜结构，低浓度的隐丹参酮并不能发挥抑制作用，证实了细菌形成生物膜后耐药性会明显增强，临床必须使用高剂量的药物浓度才能达到控制生物膜感染的目的，也说明应进一步设置药物作用的浓度梯度，寻找抑制生物膜形成的药物浓度拐点，才能真正为隐丹参酮防治生物膜耐药的SE感染提供科学的、有价值的实验依据。

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(本文编辑：左双燕)

InhibitoryeffectofcryptotanshinoneonbiofilmofStaphylococcusepidermidis

YIHui,ZURui-ling,YIYu-ling,LIYan

(CollegeofMedicalTechnology,ChengduUniversityofTCM,Chengdu611137,China)

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of cryptotanshinone on different maturation stages ofStaphylococcusepidermidis(S.epidermidis) biofilm.MethodsThe biofilm model ofS.epidermidiswas constructed in vitro, the timing of adhesion, accumulating, and maturation was determined; matrix quantity, bacterial metabolism, microstructure of biofilm were detected with semi-quantitative adhesion test, XTT assay, and scanning electron microscope(SEM) respectively.ResultsThe timing of adhesion, accumulating, and maturation ofS.epidermidisbiofilm were 6h, 24h,and 48h respectively; in adhesion period, cryptotanshinone at the concentration of 128μg/mL and 32μg/mL could both obviously reduce the matrix and kill bacteria inside biofilm, difference was statistically significant(P<0.05)，inhibitory effect of 128μg/mL cryptotanshinone was better than 32μg/mL (P<0.05), the microstructure was destroyed by both concentrations. During accumulating and mature period, only cryptotanshinone at 128μg/mL could reduce the matrix of biofilm and kill bacteria inside biofilm (P<0.05), the microstructure was damaged by cryptotanshinone at concentration of 128μg/mL, while 32g/mL of cryptotanshinone had no obvious inhibitory effect(P>0.05).ConclusionCryptotanshinone has a certain inhibitory effect on different stages ofS.epidermidisbiofilm, and there is a certain dose effect.

Staphylococcusepidermidis; biofilm; cryptotanshinone

2016-11-24

四川省科技厅应用基础项目(2015JY0159)

易辉(1991-)，女(汉族)，四川省成都市人，硕士研究生，主要从事感染微生物的实验诊断及耐药性研究。

李燕 E-mail：1067267085@qq.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.09.002

R378.1+1

A

1671-9638(2017)09-0798-06