李孝文，章洪皲，樊翠华，姜 平

（1. 南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095；2. 国家生猪产业技术体系黄陂综合试验站，湖北武汉 430344；3. 西藏新好科技有限公司，西藏拉萨 850000）

湖北省某规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征的诊断及流行毒株GP5基因特性分析

李孝文1，3，章洪皲2，樊翠华2，姜 平1

（1. 南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095；2. 国家生猪产业技术体系黄陂综合试验站，湖北武汉 430344；3. 西藏新好科技有限公司，西藏拉萨 850000）

2016年湖北省某猪场暴发一起疫情。通过病史调查、临床观察、实验室诊断，确诊该疫情为猪繁殖与呼吸综合征。对病原测序分析的结果显示：其Nsp2基因存在30个氨基酸缺失；ORF5基因与WUH1野毒株同源性最高。此外，生产母猪群和后备猪群血清样品的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ELISA N蛋白抗体S/P值离散度较大，证明该病原为高致病性PRRSV。

猪繁殖与呼吸综合征病毒；诊断；ORF5；感染状态

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种严重危害全球养猪业的重要疫病[1-3]。1996年我国首次发生该病[4]。2006年由高致病性PRRSV（HP-PRRSV）引发的疫情在我国多个养猪省份暴发，给我国养猪业带来了巨大经济损失[11]。PRRSV为不分节段的单股正链RNA病毒，基因全长约15 kb[5-6]，基因变异性较高[7]。PRRSV可分为2个基因型（Genotype），基因组同源性为60%[8-10]。ORF5基因编码的GP5蛋白与病毒免疫保护相关。不同基因型毒株的ORF5基因存在较大变异，同型毒株中ORF5的变异也较大。此外，PRRSV 的Nsp2基因变异也较大。相对PRRSV传统毒株VR2332，我国HP-PRRSV Nsp2编码区存在30个不连续氨基酸缺失[11-14]。我国商品化的PRRS活疫苗有高致病性弱毒疫苗（JXA1-R株、HuN4-F112株、TJM-F92株和GDr180株）及经典弱毒疫苗（CH-1R株、R98株）和进口减毒活疫苗（Ingelvac PRRS MLV VR2332株）。这些疫苗对控制和减缓PRRS疫情起到了积极作用。但近年来，临床上不断出PRRS疫情，疫情有抬头趋势。

通过对2016年湖北省某规模化猪场一起疫情的病史调查、临床诊断、实验室诊断，确诊该疫情为高致病性PRRS疫情。本研究为该地区规模化猪场的PRRS防控提供了参考。

1 材料与方法

1.1 发病猪场基本情况

该猪场免疫PRRS江西毒株（JXA1-R）减毒活疫苗。110日龄后备猪免疫1头份，母猪产后1周免疫1头份，产房仔猪2周后免疫0.5头份，公猪不免疫。

该猪场定期进行猪瘟、伪狂犬病抗原监测，持续进行猪瘟和伪狂犬病的免疫跟踪，为猪瘟和伪狂犬病抗原双阴性场。伪狂犬病 gE抗体阳性率为0，猪瘟抗体阳性率为100%。2015年11—12月该猪场曾暴发猪流行性腹泻疫情，产房死淘率超过30%。

1.2 疫病调查和临床观察

根据病猪体温、食欲、精神状态、皮肤发绀等表观症状以及是否有咳嗽、流鼻涕等呼吸道症状进行判断，然后根据发病猪有无神经症状进行分析。

1.3 病理学检查

按照常规方法对发病和死亡猪进行系统解剖，观察主要内脏器官的病理变化。同时，采集病变肺脏样本，固定于4%的多聚甲醛中，室温放置至少48 h，常规石蜡包埋制片，并用苏木精&伊红染色（H&E染色），光学显微镜下观察。

1.4 RT-PCR检测

病毒核酸提取：采用Takara公司的RNAiso Plus试剂盒，按产品说明书，对采集的发病猪新鲜组织样品进行核酸提取。

根据GenBank中Lelystad（M96262）、CH-1a（AY032626）和JXA1（EF112445）毒株基因序列，设计并合成2对引物。Nsp2 F：5´-CAAAGAYCAGATGGAGGAG-3´；Nsp2 R：5´-ATRATGGCTTGAGCTGAG-3´。HPPRRSV和经典PRRSV毒株Nsp2基因扩增长度分别为678 bp和768 bp。ORF7 F：5´-TCGCCCTAATTGAATAGGTG-3´；ORF7 R：5´-ATGGCCAGCCAGTCAATCA-3´。欧洲型毒株和美洲型毒株ORF7基因扩增长度分别为389 bp和434 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

RT-PCR：反转录操作按照Takara反转录试剂盒进行。反转录体系20 µL，反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 5 min。PCR反应体系25 µL：10×Easy Taq Buffer 2.5 µL、dNTP 2 µL、上下游引物各1 µL、rTaq DNA聚合酶0.5 µL、ddH2O 14 µL、cDNA模板4 µL。反应参数：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后72 ℃终延伸7 min。反应结束后，取5 µL PCR产物，在1%琼脂糖中凝胶电泳，凝胶成像系统上观察目的片段。

1.5 ORF5基因扩增与序列分析

PCR引物序列：ORF5 F：5´-ATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGCGTGCTGT-3´；ORF5 R：5´-GAGACGACCCCATTGTTCCGCTGAAACTCTG-3´。利用ORF5引物对PRRSV阳性样品进行PCR扩增。反应体系及反应参数见上述步骤。将PCR产物胶回收纯化后与pMD-18T载体连接。对重组质粒经酶切鉴定正确后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。应用MegAlign软件对测序获得的GP5序列进行比对分析，并利用MEGA5.2软件，根据Neighbor-Joining运算法绘制遗传进化树（比对值为1 000个重复）。

1.6 ELISA抗体检测

采集血清样品59份，其中生产母猪44份、后备母猪15份。采用ELISA方法检测PRRS抗体。关于PRRS抗体的阳性或阴性，通过计算样品与阳性对照的比值（S/P）进行判定：S/P值大于2.5时，判定样品可能存在PRRSV野毒感染。具体操作方法和步骤按照IDEXX试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 发病情况调查结果

该猪场位于湖北省南部，2013年初从某种猪公司引入后备猪投产使用，至2014年5月存栏基础母猪1 200头左右。该规模场持续生产至2016年4月，生产成绩稳定。2016年4月引入后备母猪1 200头。此后猪群出现持续20余天的发烧和呼吸道症状。2016年6月后备猪入群、配种。随后母猪群出现零星流产、返情和产死胎现象。10月后备母猪在妊娠后期出现持续发烧、流产症状；11月经产母猪出现繁殖障碍。产仔舍仔猪发烧、出现神经症状、腿部肿胀等；断奶转至保育舍，在42日龄左右出现喘气、发烧、突然倒地死亡现象，咳喘比例超过20%，腿部肿胀、角弓反张等神经症状多见。保育期呼吸道症状明显，伴随高烧和高死淘率，外观耳尖发绀（图1）。

图1 猪场妊娠母猪流产和保育仔猪临床症状

2.2 病理变化

产房仔猪肺脏支气管和细支气管中充满大量白色粘液；肺部出现明显的“间质性肺炎”外表观状；肺尖叶开始呈现弥漫性病变，肺脏发生实变；2周龄仔猪出现肺脏肋骨压痕。扁桃体、颌下淋巴结、腹股沟淋巴结等器官未见眼观病变。保育仔猪淋巴结肿大，支气管充满大量泡沫，肺脏质地变硬，肺尖叶呈现弥散性病变（图2）。

组织病理学检查：病猪肺脏显微结构完全消失；小叶间隔增厚；大量炎性细胞及坏死细胞碎片浸润于肺泡腔及支气管周围（图3）。

图2 发病仔猪肺脏肉眼病变

图3 发病仔猪肺脏组织病理学观察结果（放大倍数为20×10）

2.3 RT-PCR检测结果

PRRSV ORF7基因RT-PCR结果显示，检测样品中可扩增出434 bp的片段，表明该猪场中有美洲型PRRSV存在（图4-a）。

PRRSV Nsp2基因RT-PCR结果显示，扩增条带大小约678 bp（图4-b），表明该猪场存在HPPRRSV毒株感染。

图4 猪场临床样品ORF7基因和Nsp2基因RT-PCR扩增结果

2.4 ORF5基因序列分析结果

针对4个临床样品和12株GenBank公布的有代表性毒株的ORF5基因全序列进行遗传进化树分析，结果显示，本次研究的4株PRRSV分离株均属美洲型毒株，与HP-PRRSV WUH1毒株同源性最高，隶属同一分支（图5）。

2.5 种猪血清抗体调查结果

利用IDEXX PRRSV抗体检测试剂盒，对生产母猪群和后备猪群血清样品中N蛋白抗体进行检测。结果表明，母猪群与后备猪群PRRS抗体S/ P值大于2.5的占比分别为40.9%和30.0%，离散系数分别是61.6%和48.5%（表2），提示生产母猪与后备母猪感染了PRRSV野毒。

3 讨论

PRRSV具有广泛的变异和毒株多样性特点，导致疫病的局部暴发和再流行[3，11，16-18]。2006年HP-PRRSV导致的疫情在我国南方多省暴发，并成为我国优势流行毒株。2011年高致病性PRRS活疫苗在我国获批，并在田间得到广泛使用，为该病的控制发挥了重要作用。但随着猪群免疫选择压力的增加，PRRSV遗传和演化相应加速[20]。一些毒力稍低的PRRSV毒株Nsp2基因同样存在30个不连续氨基酸缺失[15]。PRRSV经典毒株和低致病性毒株时有报道[19]。欧洲型PRRSV在我国相继出现，使得PRRSV感染更为复杂[21]。因此，定期监测和调查猪场PRRSV毒株多样化及分析野生毒株的遗传及演化进程，对临床上PRRS的防控具有重要意义。本研究通过临床诊断、病理变化、RT-PCR、血清学检测和测序分析，确诊本次疫情为高致病性PRRS疫情。

PRRSV致病和免疫机制目前尚不十分清楚，疫苗免疫效果尚不理想，因此该病防控需要依靠综合性防控措施。该猪场建场以来，疫情一直稳定，但本次发病严重，持续时间较长，其原因可能是：首先，猪场原本无PRRSV感染情况，为扩大养猪生产规模引进后备母猪，但没有经过系统检测，引进的后备母猪可能存在健康带毒问题。其次，该猪场采用母猪舍、保育舍和育肥舍组成的两点式饲养管理模式，发生疫情时无法迅速切断病毒的水平传播途径，导致猪场疫情持续时间较长。本次发病病原属于HP-PRRSV。该流行毒株可能存在抗原性变异。由该病原引发的疫情近年来在湖北省其它猪场也有类似报道[22]。因此，加强该流行毒株的变异监测，建立该病综合防控体系十分必要。

同时，我国猪场尚缺乏完善的生物安全措施；无序引种和引入带毒种猪造成多毒株在猪场共存和循环。还有，不加限制地大范围使用PRRSV减毒活疫苗造成了PRRSV的广泛传播。因此，合理、有条件地使用PRRSV减毒活疫苗对该病防控十分重要。

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（责任编辑：朱迪国）

Diagnosis of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome and Characteristics Analysis of GP5 Gene of Epidemic Strains in a Large-scaled Swine Farm in Hubei Province

Li Xiaowen1，3，Zhang Hongjun2，Fan Cuihua2，Jiang Ping1
（1. College of Veterinary Medicine，Nanjing Agricultural University，Nanjing，Jiangsu 210095；2. Huangpi Comprehensive Experimental Station，National Pig Industry Technology System，Wuhan，Hubei 430344；3. Tibet Xinhao Technology Co. Ltd，Lasa，Tibet 850000）

An outbreak of PRRS was confirmed at a swine farm in Hubei Province in 2016，by means of history investigations，clinical symptom observations and laboratory diagnoses. The results of the PRRSV isolate sequencing indicated that it had a 30-amino-acid（30-aa）deletion in the Nsp2-coding region. And the homology between ORF5 gene and WUH1 wild strain was the highest. In addition，the S/P values of PRRSV，ELISA and N protein antibodies were highly dispersed in sows and reserve pig serum samples，indicating that the pathogen was highly pathogenic PRRSV.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）；diagnosis；ORF5；infection status

S852.23

B

1005-944X（2017）09-0011-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.09.004

国家生猪产业体系项目（CARS-36）

姜 平