禹小芳，邹玖零，张 强，黄建龙，李英明，郝知友，屈蓓蓓，周争先，罗 军，尹秋元

（1. 永州市畜牧水产局，湖南永州 425000；2. 湖南省兽医局，湖南长沙 410000；3. 湖南省动物疫病预防控制中心，湖南长沙 410000）

一起鸡感染H7N9流感病毒变异株的调查

禹小芳1，邹玖零1，张 强2，黄建龙3，李英明1，郝知友1，屈蓓蓓1，周争先1，罗 军1，尹秋元1

（1. 永州市畜牧水产局，湖南永州 425000；2. 湖南省兽医局，湖南长沙 410000；3. 湖南省动物疫病预防控制中心，湖南长沙 410000）

[目的] 通过对鸡H7N9流感病毒（变异株）感染临床解剖特征的描述以及H7N9流感病毒变异株来源的探讨，为今后该病的临床诊断以及防控提供借鉴。[方法] 采用流行病学调查、临床解剖、实时荧光定量RTPCR、病毒分离测序等方法。[结果]病鸡外观症状与解剖症状均明显；H7、H9流感病毒核酸检测阳性；该分离株与2013年分离毒株（A/Anhui/1/2013（H7N9）的HA、NA基因核苷酸同源性分别为97.8%～97.9%、97.8%。[结论]鸡的感染死亡是由H7N9流感病毒（变异株）引起的；该变异株引发疫情迅猛，传染速度快，致死率高，应加强对其防控。

H7N9流感病毒；变异株；临床特征；病毒重组

禽流感（Avian influenza，AI）是由流感病毒引起的禽类感染或疾病综合征。流感病毒属于RNA病毒的正黏病毒科，其最显著的生物学特性是亚型众多、变异频繁。其分子机制涉及点突变引起的抗原漂移（Antigenic drift）和不同亚型毒株同源重组产生新亚型所引起的抗原转变（Antigenic shift）[1]。流感病毒根据两个蛋白抗原性的不同，可被分为16个HA 亚型（H1～H16） 和9个NA亚型（N1～N9），理论上流感病毒可组成144个亚型[2]。高致病性禽流感病毒目前仅见于H5、H7两个亚型。它们从水禽传给陆禽，经过几代传播以后，从低致病性演变成高致病性病毒。关于H7N9流感病毒变异株分子特征、人感染后的临床症状已有报道[3]，但未见禽感染H7N9流感病毒变异株临床特征的报道。因此，研究禽感染H7N9流感病毒变异株的临床特征及变异株的来源，对重大动物疫病防控是有意义的。

1 材料与方法

1.1 病例来源

发病鸡来自湖南省永州市东安县端桥铺镇某养禽场。该禽场存栏蛋鸡6 000余羽，品种为海兰灰，320日龄。至发病第4日，累计死亡102羽。分别随机采集8只发病鸡的咽/肛拭子及血液样品，备用。

1.2 流行病学调查

向养殖户、饲养员、防疫技术员询问关于鸡发病的相关信息，并对饲料、用药进行取证调查。

1.3 病理解剖

随机选择8只发病鸡进行临床解剖，对发病鸡的气管、心脏、肝脏、肾脏等器官进行病理解剖并拍照，做好记录。

1.4 实验室检测

1.4.1 检测试剂。禽流感病毒H5（Re-6株）、H7亚型血凝抑制试验抗原（哈尔滨维科生物技术开发公司出品，批号201605）；禽流感病毒H5/ H7/H9型实时荧光RT-PCR检测试剂盒（深圳生科源生物科技有限公司产品，批号201506）。

1.4.2 检测方法。关于禽流感病原学检测，按禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法（GB/T 19438.1—2004）。从样品中提取病毒 RNA 后，以实时荧光定量反转录-聚合酶链反应法（real-time RT-PCR）检测H5/H7/H9 亚型核酸。关于禽流感抗体检测，按高致病性禽流感诊断技术（GB/T 18936—2003）进行血凝和血凝抑制试验，并记录相关数据。

1.4.3 数据处理。将有关数据录入Excel 2003软件，通过 SPSS 13. 0 软件进行统计分析，使用GraphPad Prism 5软件制图。

2 结果与分析

2.1 流行病调查结果

发病前100 d，养鸡场实施过H5亚型流感疫苗和“H5+H9”联苗（广东永顺）免疫，饲养状况良好，并无其他烈性发病情况。发病后的前4 天，分别死亡10、18、31、102羽（图1）；死亡的前几天，病鸡采食量、产蛋量无明显变化，外观正常；至濒死日，呈现明显的外观症状：精神萎靡、头部肿大、肉髯发绀、流泪、口流涎（图2），也有部分鸡在采食过程中突然死亡。由于鸡发病迅猛，死亡快，无脚趾出血症状。

图1 发病禽场日死亡数量

图2 发病3日的病危鸡

2.2 病理解剖

临床解剖8只发病鸡，发现病理症状明显（图3）。普遍呈现：支气管充血，呈现条纹状血带；肌胃旁脂肪有星点状出血；腺胃乳头有充血、出血；心包充血，心包液浑浊；肝脏肿大；肾脏肿大，呈花斑状；十二指肠局部出血；输卵管发绀，呈蛋清样；卵泡变形液化；个别脑膜出血。

图3 病理解剖各器官病变

2.3 实验室检测结果

对采集的各8份咽/肛拭子及血液样品进行编号，采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应、血凝和血凝抑制试验进行抗原、抗体检测。检测结果见表1。在咽/肛拭子样品中检出H7、H9流感病毒核酸，且H7流感病毒核酸阳性检出率达100%。对血清样品进行H5、H7抗体检测，所有样品均无H7抗体，H5抗体水平达27，实验室诊断为疑似H7流感。经哈尔滨兽医研究所病毒分离测序检测，确诊为H7N9流感（变异株）。

表1 咽/肛拭子及血液样品实验室检测结果

3 讨论

H7N9流感病毒变异有几种：一是发生点突变，包括碱基的替换、插入或缺失；二是不同亚型流感病毒之间发生基因重组。2013年在上海市流行的新型H7N9流感经检测认为是由野鸟H7N9病毒（NA节段）、浙江H7N3病毒（HA节段）及北京市、上海市、江苏省和浙江省等地的家禽H9N2病毒（除NA与HA节段外）重组而产生的[4]。而此次采集的样品，经哈尔滨兽医研究所检测，均检测到H7N9流感病毒。经序列分析发现，上述H7N9流感病毒分离株与我国2013年A/ Anhui/1/2013（H7N9）毒株的HA和NA基因核苷酸同源性分别为97.8%～97.9%和97.8%。其中，HA基因裂解位点均有4个氨基酸增加，为变异株。本次抗原核酸检测发现，该发病鸡场也存在H7、H9等亚型流感病毒，且H9阳性率较高。这为变异株的重组提供了可能，所以不排除此H7N9流感变异株是由其它亚型流感病毒重组而来的可能。

流感病毒除了本身变异造成多样性外[5]，还由于病毒来源的多样性以及病毒之间的重组与重排[6]而导致病毒生物特性的改变。从外观症状来看，此次的禽H7N9流感病毒变异株感染相比其它类型的禽流感感染，发病速度更迅猛，致死速度更快。以往禽感染禽流感后主要表现为采食量下降、产蛋量减少，出现软壳蛋，脚趾出血等外观症状。然而此次H7N9流感变异株感染多表现为急性经过，甚至鸡不表现明显外观症状而快速死亡。有研究表明，H7N9流感在哺乳动物貂和猪中也具有一定的传染性[7]，这给重大动物疾病防控提出了更大考验，也给现代养殖卫生条件设施提出了更高要求。H9亚型流感病毒虽并不能使禽致病，但是其一方面能抑制机体的免疫，另一方面也可能重组其它亚型流感病毒，导致变异，因此给现代养禽行业的疾病防控提出了更高要求。

H7N9流感（变异株）对养禽业和人类健康的影响已经引起了社会的广泛关注。人们应该充分认识禽感染H7N9流感（变异株）的危害，加强对其的预防与控制，确保养禽业顺利发展。

[1] 张赛，陆军. H7N9 禽流感病毒基因检测技术研究进展[J].医学综述，2015（12）：2226-2228.

[2] MUKAIGAWA J，NAYAK D P. Two signals mediate nuclear localization of influenza virus（A/WSN/33）polymerase basie protein2[J]. Virol，1991，65：245-253.

[3] 修文琼，郑奎城. 新型H7N9禽流感病毒研究进展. 中国人兽共患病学报2014，30（6）：636-644.

[4] 张宝，黄克勇，郭劲松，等. H7N9 病毒的来源和重组模式[J]. 南方医科大学学报，2013，33（7）：1017-1021.

[5] BAO C J，CUI L B，ZHOU M H，et al. Live-animal markets and influenza A（H7N9）virus infection[J]. N Engl J Med，2013，368（24）：2337-2339.

[6] XIONG C，ZHANG Z，JIANG Q，et al. Evolutionary characteristics of a/Hangzhou/1/2013 and source of avian influenza virus H7N9 subtype in China[J]. Clin Infect Dis，2013，57：622-624.

[7] ZHU H，WANG D，KELVIN D J，et al. Infectivity，transmission，and pathology of human H7N9 influenza in ferrets and Pigs[J]. Science，2013，341（6142）：183-186.

（责任编辑：朱迪国）

An Investigation on Chicken Infection with H7N9 Infuenza Virus Variants

Yu Xiaofang1，Zou Jiuling1，Zhang Qiang2，Huang Jianlong3，Li Yingming1，Hao Zhiyou1，Qu Beibei1，Zhou Zhengxian1，Luo Jun1，Yin Qiuyuan1
（1. Yongzhou Animal Husbandry and Fishery Bureau，Yongzhou，Hunan 425000；2. Hunan Veterinary Bureau，Changsha，Hunan 410000；3. Hunan Animal Disease Prevention and Control Center，Changsha，Hunan 410000）

[Objective] To explore the clinical features of H7N9 influenza virus（mutant）and the recombination possibility of H7vvN9 influenza virus mutant，and to provide reference for clinical diagnosis and disease prevention and control in the future. [Methods] Epidemiological survey，clinical anatomical diagnosis，real-time quantitative RTPCR method，virus isolation sequencing were used. [Results] The appearance and anatomical symptoms of sick chicken were obvious. The results of H7 and H9 subtype detection were positive. The nucleotide homology of the virus isolates in HA and NA gene of A/Anhui/1/2013（H7N9） were 97.9% and 97.8%，respectively. [Conclusion] The infectious death of chicken was caused by H7N9 influenza virus（mutant）. The outbreak caused by this strain was rapid，fast and lethal，and should be strengthened and prevented.

H7N9 influenza virus；variant strain；clinical features；viral recombination

S851.3

A

1005-944X（2017）09-0004-03

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.09.002