唐晓华 董文静 骆丰 陈琳 章浙忠⋆

·实验研究·

冬凌草甲素对胃癌Sgc-7901细胞炎性细胞因子的影响

唐晓华 董文静 骆丰 陈琳 章浙忠⋆

目的 通过体外无菌培养Sgc-7901细胞，观察加入冬凌草甲素后，Sgc-7901细胞炎性因子表达的影响，评价冬凌草甲素对Sgc-7901细胞炎性因子的变化差异，探讨冬凌草甲素抗肿瘤的机制，为临床治疗胃癌提供新的理论依据。方法 无菌培养Sgc-7901细胞，CCK-8实验筛选冬凌草甲素作用24h后抑制Sgc-7901细胞增殖的最佳作用浓度；液相芯片分析系统测定冬凌草甲素对Sgc-7901细胞IL-2、IL-4、IL-6、IL-10以及TNF-α炎性因子的影响。结果 CCK-8实验结果显示，冬凌草甲素能抑制Sgc-7901细胞增殖，并且呈剂量依赖性，且IC50分别是66.88μm；液相芯片分析系统检测冬凌草甲素处理前后Sgc-7901细胞IL-2、IL-4、IL-6、IL-10以及TNF-α炎性因子差异表达结果显示：冬凌草甲素组与空白对照组比较，部分炎性因子表达下调。结论 冬凌草甲素可以抑制Sgc-7901细胞的增殖，下调了Sgc-7901细胞中IL-6等炎性因子的分泌，从而达到抗肿瘤的作用。

冬凌草甲素 Sgc-7901 炎性细胞因子

据国内外肿瘤流行病学调查发现，随着生存坏境的日益恶化，人类生活饮食等生存方式的改变，恶性肿瘤的发病率和病死率呈明显上升的趋势，恶性肿瘤已经成为我国乃至全球性的公共健康问题［1］，严重威胁人类的生活质量。冬凌草具有清热解毒﹑消炎止痛﹑抗肿瘤之功效［2-3］，素有“人间仙草”之美称。冬凌草甲素（Oridonin，Ori）是从冬凌草中提取的二萜类化合物，是抗肿瘤的主要活性成分，是中药中的光谱抗生素。研究表明，冬凌草甲素对胃癌﹑胰腺癌等肿瘤细胞有一定的疗效［4］，而细胞分泌的白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎性细胞因子与胃癌﹑胰腺癌等肿瘤细胞有一定的相关性，当炎性因子比例失调时，可刺激肿瘤细胞恶性生长，血管和淋巴管生成以及肿瘤的浸润，因此作者认为冬凌草甲素在一定程度上可以引起胃癌细胞炎性因子的改变。目前，传统的手术治疗以及辅助放化疗仍是胃癌的主要治疗方式，然而手术治疗无法彻底根除胃癌细胞，细胞二次复发率高，且放化疗有明显的毒副作用。因此，探索寻求一种新型的治疗胃癌的方式以及药物成为今后重要的研究热点。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人胃癌细胞Sgc-7901购自中国科学院上海细胞研究所。

1.2 主要试剂 冬凌草甲素（HPLC≥98%）（TAUTO BIOTECH）；RPMI 1640培养液（浙江吉诺生物医药技术有限公司）；DMEM培养液（浙江吉诺生物医药技术有限公司）；0.25%胰蛋白酶（浙江吉诺生物医药技术有限公司）；PBS缓冲液［pH（7.2±0.1）］（浙江吉诺生物医药技术有限公司）；无支原体胎牛血清（FB）（浙江天杭生物科技有限公司）；二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma公司）；Cell Counting Kit-8（CCK-8试剂盒）（碧云天生物技术研究所）；人细胞因子磁珠面板（美国 EMD Millipore公司）。

1.3 主要仪器 二氧化碳培养箱（美国 Thermo公司，型号HEPA CLASS 100 3111）；低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司，型号SC-3610）；恒温水浴箱（上海森信实验仪器有限公司，型号DK-S24）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司，型号5541R）；Luminex 200 液相悬浮芯片系统（美国Luminex 公司，型号LX10009118401）。

1.4 方法 （1）人胃癌细胞Sgc-7901培养：人胃癌细胞Sgc-7901培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640，在37℃﹑5% CO2的恒定条件培养箱培养，当细胞汇合度＞80%，缓慢弃去原培养液，加入适量含EDTA的0.25%胰酶溶液，37℃﹑5% CO2培养箱中作用2～3 min，于倒置显微镜下观察，当细胞间隙增大或皱缩成圆形时，立即弃去胰酶，加入2倍体积含10%FBS的完全培养液终止消化，反复轻柔吹打使细胞脱落，1000r/min离心5min收集细胞并弃去上清液，用适量培养液重悬细胞使细胞成为单细胞悬液，计数并调整细胞浓度接种于新细胞培养瓶中培养。（2）CCK-8法检测冬凌草甲素抑制BXPC-3/PANC-1﹑Sgc-7901﹑Hct 116细胞增殖实验：将培养好的Sgc-7901细胞以5.0×104个/ml传代培养于96孔板中，每孔100μl，于37℃﹑5% CO2培养箱孵育24h左右，待细胞贴壁后，弃去原培养液，按分组分别加入含不同浓度冬凌草甲素的培养液100μl，使其终浓度为0﹑16﹑32﹑64﹑128μm，并设置调零孔，每组5个重复孔，96孔板四周用PBS填充，继续培养24 h，每孔加10 μl CCK-8溶液，继续培养4 h后从培养箱中取出，以酶标仪570 nm处测定OD值。（3）液相芯片分析系统检测冬凌草甲素处理前后对Sgc-7901细胞炎性因子差异表达：将培养好的Sgc-7901细胞接种于24孔板，每孔接种3×104个/2×104个细胞，待细胞融合度达60%左右时，按分组进行处理：对照组更换新的培养液，冬凌草甲素实验组更换成含66.88μm冬凌草甲素的培养液液，每组设3个重复孔，分别继续培养12h﹑24h和36h，收集细胞培养液，2000r/min离心10min，取上清，-80℃保存备用。取出试剂盒和样本，按仪器操作说明操作检测，最后在滴定板所有孔中加入150μl鞘液，摇床上震荡5min后，使微球呈悬浮状态，将板子置入Luminex 200TM，执行软件后，保存并分析MFI结果，计算样品中的炎症细胞因子浓度。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 冬凌草甲素对Sgc-7901细胞增殖活力的影响 由图1和图2可知，冬凌草甲素能显著抑制Sgc-7901细胞增殖，并且呈剂量依赖性，通过SPSS17.0软件计算可得：作用时间为24h时冬凌草甲素抑制Sgc-7901细胞增殖的IC50为66.88μm。

2.2 冬凌草甲素对Sgc-7901细胞分泌炎性因子表达的影响 通过液相芯片系统检测冬凌草甲素作用前后人胃癌Sgc-7901细胞IL-2﹑IL-6﹑IL-10﹑TNF-α以及IFN-g等炎性因子差异表达。实验结果显示：冬凌草甲素能有效的不同程度下调Sgc-7901细胞IL-6分泌。用66.88μm浓度的冬凌草甲素作用于Sgc-7901细胞12h，24h和36h后，对照组，冬凌草甲素实验组（12h组﹑24h组﹑36h组）的IL-6分别为（1.93±0.21）pg/ml﹑（1.4±0.1）pg/ml﹑（1.33±0.29）pg/ml﹑（1.23±0.21）pg/ml。与对照组比较，冬凌草甲素实验组IL-6的表达明显下降（P＜0.05）。IL-2﹑IL-10﹑TNF-α以及IFN-g等炎性因子差异表达不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 冬凌草甲素对Sgc-7901细胞OD值的影响

图2 冬凌草甲素对Sgc-7901细胞抑制率的影响（%）

3 讨论

冬凌草，味苦甘，性微寒，具有清热解毒﹑消炎止痛﹑抗肿瘤之功效［2-3］。冬凌草甲素是从冬凌草中提取的二萜类化合物，为抗肿瘤的主要活性成分。对于冬凌草甲素，有研究报道：冬凌草甲素对胃癌有一定的疗效［4］。冬凌草甲素能刺激p21waf1蛋白高表达，扰乱细胞进程而抑制细胞增殖。李娜等［5］发现冬凌草甲素在体外可显著抑制人卵巢癌细胞株SKOV3的增殖，且诱导其凋亡作用，由此可以初步推测冬凌草甲素可以抑制胃癌细胞的增殖。

胃癌在临床上是主要常见的恶性消化道肿瘤之一，据中国肿瘤流行病学统计发现，胃癌发病率高居前二位，且发病率呈上升趋势，给人类的生存和发展带来了巨大威胁。目前常用的治疗方法有药物治疗﹑手术治疗﹑放射治疗，但这种方式给患者的后期生活质量带来了无穷的痛苦。因此，寻一种新的治疗手段或者探究一种有用的抗消化道肿瘤新药是目前的重点。

胃癌的发病机制目前仍不明确，其发生﹑发展﹑浸润以及转移是一个多方因素相互影响的复杂过程，具有“慢性炎症”的表现，而炎症因子在胃癌的生成过程中起到至关重要的作用。通过上述实验发现，用66.88μm浓度的冬凌草甲素作用于Sgc-7901细胞12h﹑24h和36h后，对照组和冬凌草甲素实验组（12h组﹑24h组﹑36h组）的IL-6分别为（1.93±0.21）pg/ml﹑（1.4±0.1）pg/ml﹑（1.33±0.29）pg/ml﹑（1.23±0.21）pg/ml。与对照组比较，冬凌草甲素实验组IL-6的表达明显下降（P＜0.05）。研究表明：IL-6是一种前炎因子，可以通过体外肿瘤细胞自体分泌，其与IL-1﹑肿瘤坏死因子一起诱导炎症反应的急性期，启动免疫应答。大多数学者认为，与IL-6相关的肿瘤血清中IL-6水平增高以及受体表达异常，因此，IL-6及其受体的平衡失调常会影响整个机体的内环境稳定，最终导致机体免疫功能紊乱，诱导肿瘤的发生。液相芯片分析系统检测，统计后发现，IL-2﹑IL-10﹑TNF-α以及IFN-g等炎性因子差异表达不明显（P＞0.05），考虑本实验只针对体外无菌的人胃癌Sgc-7901细胞培养，无机体免疫系统参与，因此难以检测到IL-2﹑IL-10﹑TNF-α以及IFN-g等炎性因子。研究发现，IL-4和IL-10等抗炎因子通过抑制IL-6等促炎因子的分泌，改变肿瘤的微环境，造成肿瘤细胞的增殖［6］。抗炎因子和促炎因子相互抑制﹑相互作用，当两者失调时，肿瘤细胞生存的微环境改变，造成肿瘤的发生发展。此外，在一些无胃炎等发病基础的原发性消化道肿瘤中发现，肿瘤组织中伴有大量炎性细胞的浸润以及炎性因子表达的上升。因此，在体外培养的Sgc-7901细胞中，虽然L-2﹑IL-10﹑TNF-α以及IFN-g等炎性因子未明确表达。炎症与肿瘤之间的相关作用机制复杂，作者将通过动物实验进一步探讨冬凌草甲素抗胃癌的作用机制，为中药抗肿瘤提供了新的思路和新的方向。

［1］ 陈万青,郑荣寿,曾红梅,等．2011年中国恶性肿瘤发病和死亡分析．中国肿瘤,2015,24(1):1-10．

［2］ 刘淑云,谭英姿,范明松,等．冬凌草甲素研究进展．中国当代医药,2012,19(13):17-18．

［3］ 高世勇,王珑．冬凌草的化学和药理作用研究．哈尔滨商业大学学报(自然科学版),2014,30(1):1-6．

［4］ 刘家云,魏敏,顾琴龙．冬凌草甲素抗肿瘤的研究进展．中国新药与临床杂志,2010,29(2):81-84．

［5］ 李娜,金平,张春洁．冬凌草甲素诱导人卵巢癌 SKOV3细胞凋亡及其机制．肿瘤防治研究,2013,40(1):36-41．

［6］ Noguchi S,Hattori M,Sugiyama H,et al．Lactobacillus plantarum NRIC1832 enhances IL-10 production from CD4+T cells in vitro．Biosci Biochem,2012,76(10):1925-1931．

Objective To observe the effect of the expression of infl ammatory cytokines in Sgc-7901 after adding the oridonin and to evaluate oridonin on the changes of infl ammatory cytokines in Sgc-7901 and the effects of oridonin on anti-tumor mechanism through SGC-7901 cells cultured in vitro by sterile，then provide a new theoretical basis for the clinical treatment of gastric cancer. Methods Sgc-7901 cells fostered in sterile culture，through CCK-8 experiment，the optimal concentration to inhibit the proliferation of Sgc-7901 cells were screened to oridonin after 24h. Liquid chip analysis system for determination of oridonin on the effect of IL-2，IL-4，IL-6，IL-10 and TNF-α in Sgc-7901 cells. Results CCK-8 experiment results showed that oridonin could inhibit the proliferation of Sgc-7901 cells in a dose-dependent manner，and the IC50 was 66.88μm. The results of Liquid chip analysis system that to test the differential expression of IL-2，IL-4，IL-6，IL-10 and TNF-α after oridonin treated Sgc-7901 cells before and after showed that partial infl ammatory factors expression down regulated，the oridonin group with the blank control group were compared. Conclusion Oridonin can inhibit the proliferation of Sgc-7901 cells，and reduce the secretion of IL-6 and other infl ammatory factors in Sgc-7901 cells，so as to achieve anti-tumor effect.

Oridonin Sgc-7901 Infl ammatory cytokines

浙江省中医药科技计划项目（2016ZB038）；浙江中医药大学校级科研基金项目（2015ZY10）

310000 浙江省中医院

*通信作者