鲁遥 张岚尔 骆丰 陈琳 章浙忠⋆

冬凌草甲素对乳腺癌Bcap-37细胞凋亡影响的研究

鲁遥 张岚尔 骆丰 陈琳 章浙忠⋆

目的 通过体外无菌培养乳腺癌Bcap-37细胞，观察冬凌草甲素对Bcap-37细胞的活性以及凋亡的影响，探索冬凌草甲素的抗肿瘤机制。方法 无菌培养Bcap-37细胞，冬凌草甲素浓度为0、1、2、4、8、16、32、64μg/ml，作用12、24、36、48h时，采用MMT法检测冬凌草甲素抑制Bcap-37细胞活性；冬凌草甲素浓度为8μg/ml、32μg/ml，作用24h，流式细胞术检测冬凌草甲素对Bcap-37细胞凋亡的影响。结果 冬凌草甲素对乳腺癌Bcap-37细胞有增殖抑制以及诱导凋亡的作用。结论 冬凌草甲素可抑制乳腺癌Bcap-37细胞的增殖以及诱导细胞凋亡，为临床治疗乳腺癌提供了新的依据。

冬凌草甲素 Bcap-37细胞 细胞凋亡

据2011年全球癌症统计，全球新增乳腺癌患者1380000例，占同期新增癌症患者例数的23%，死亡率则占同期癌症死亡率的14%［1］，目前仍无公认的最佳治疗药物。随着新型抗肿瘤药物的不断更新，乳腺癌治疗后生存率也有所提高，但始终未达到理想的临床效果。虽然手术治疗是乳腺癌的首选治疗方案，但是晚期乳腺癌以及远处转移的乳腺癌仍然威胁患者的生命，如何有效控制乳腺癌的发展以及促进癌细胞的凋亡是本研究的主要目的。冬凌草甲素是从冬凌草中提取天然类化合物，味甘苦，性微寒，具清热解毒﹑消炎止痛﹑健胃活血及抗肿瘤之功用，素有“人间仙草”之美称［2］。本研究将不同浓度冬凌草甲素作用于Bcap-37细胞，观察冬凌草甲素对Bcap-37细胞的活性以及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞 乳腺癌Bcap-37购自中科院上海细胞研究所。

1.2 主要试剂 冬凌草甲素（HPLC≥98%）（TAUTO BIOTECH）；PBS缓冲液（PH7.2±0.1）（吉诺生物）；无支原体胎牛血清（FB）（天杭生物）；RPMI 1640培养液（吉诺生物）；噻唑蓝（MTT）﹑二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma公司）；0.25%胰蛋白酶（吉诺生物）；Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒（联科生物）；DMEM培养液（吉诺生物）。

1.3 仪器 酶标仪（美国Dynatech公司，型号MR-4100）；细胞培养箱（美国Thermo公司，型号HEPA CLASS 1003111）；倒置显微镜（日本OLYMPUS公司，型号CKX31）；荧光显微镜（日本OLYMPUS公司，型号IX71）；流式细胞仪（美国guava 公司，型号guava easyCyte 6-2L）。

1.4 方法 （1）细胞培养：将Bcap-37细胞置于DMEM高糖培养液中，37℃，5%CO2培养箱中培养。传代时，按1：1加入0.25%胰酶和DMEM高糖培养液，待胰酶消化后，离心后收集细胞悬液至培养瓶中继续培养，细胞传代3次后可用于实验。（2）MTT法检测细胞增殖活力：采用MTT法检测，将1.0×104个/孔的密度细胞传代培养于4个96孔板中。冬凌草甲素浓度设置为0﹑1﹑2﹑4﹑8﹑16﹑32﹑64μg/ml，培养时间分别设置为12﹑24﹑36﹑48h，每组5个复孔，继续培养。定时加入20μl 5 mg/ml MTT溶液，继续培养4h后弃去培养液，加入150μl DMSO，在570nm波长处检测各孔吸光度值（A570）。细胞活力计算公式：细胞活力（%）=（加药组A570 -空白组A570）/（对照组A570 - 空白组A570）×100%。独立重复三次实验。（3）流式细胞术检测细胞凋亡：实验分组设置为：对照组﹑8μg/ml组和32μg/ml组。将1.0×104个/孔的密度细胞传代培养于24孔板中，待细胞贴壁后，按照设定浓度加入冬凌草甲素培养液，重复3次，培养24h后低速离心收集细胞，加入PBS重悬液后洗涤倾去上清液，加入1×binding buffer 500μl重悬细胞呈单细胞悬液，然后加入5μl Annexin V和10μl的PI，避光室温孵育5min后，上机检测；测定细胞数为10000 个；使用guava 微流式细胞分析仪Nexin程序。独立重复三次实验。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 冬凌草甲素对Bcap-37细胞增殖活力的影响 冬凌草甲素浓度能有效地抑制Bcap-37细胞增殖，呈剂量-时间依赖性。冬凌草甲素抑制Bcap-37细胞增殖的最佳抑制浓度为32 μg/ml，最低抑制浓度为8 μg/ ml，最佳作用时间为24h。32 μg/ml的冬凌草甲素作用于细胞24h后，Bcap-37细胞活力为（19.89±2.19）%，明显低于对照组，且差异具有统计学意义（P＜0.01）。见图1。

图1 冬凌草甲素对Bcap-37细胞增殖活力的影响

2.2 冬凌草甲素对Bcap-37细胞凋亡的影响 8 μg/ ml的冬凌草甲素作用于Bcap-37细胞24 h后，凋亡比例为5.45±0.21%；32 μg/ml冬凌草甲素作用于Bcap-37细胞24 h后，凋亡比例为14.85±0.92%，与空白组（1.9±0.17%）相比，早期凋亡细胞的比例显著提升，且差异具有统计学意义（P＜0.01），结果提示冬凌草甲素能引起Bcap-37细胞的凋亡，且呈一定的剂量依赖性。见图2。

图2 流式细胞术检测冬凌草甲素对Bcap-37细胞凋亡的影响

3 讨论

乳腺癌是全球女性中最常见的一种肿瘤，并且逐渐成为了一种全球性的问题，尽管乳腺癌的预后有大幅改善，但是在中低收入国家，乳腺癌的病死率仍较高。乳腺癌的病因尚未完全清楚，从前期研究发现其可能与内源性或外源性雌激素的长期作用﹑乳腺导管和小叶的不典型增生﹑营养状况﹑遗传家族史等均有关联，目前常用的治疗方法有药物治疗﹑手术治疗﹑放射治疗［3-5］，但是新观点和新研究使人们深入地认识到乳腺癌仅依靠单一的治疗方法是不能达到根治的目的，必须采取综合治疗手段，有效杀死或抑制癌细胞的生长，减少体内癌负荷，增强机体免疫力，提高自身抗癌能力。

冬凌草甲素是从冬凌草中提取的天然类化合物，可作为新型防癌剂，具有抗肿瘤作用［2］。有学者研究发现，冬凌草甲素能有效抑制肿瘤细胞增殖，但作用机制尚不明确。通过以上实验数据发现，冬凌草甲素能显著抑制Bcap-37细胞的增殖，且最佳抑制浓度为32 μg/ml，32 μg/ml的冬凌草甲素作用于Bcap-37细胞24h后，细胞活力为（19.89±2.19）%，明显低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。通过流式细胞术检测发现，8μg/ml的冬凌草甲素作用于Bcap-37细胞24 h后，凋亡比例为（5.45±0.21）%；32 μg/ml冬凌草甲素作用于Bcap-37细胞24 h后，凋亡比例为（14.85±0.92）%，与空白组（1.9±0.17%）相比，早期凋亡细胞的比例显著提升，且差异具有统计学意义（P＜0.01），结果提示冬凌草甲素能引起Bcap-37细胞的凋亡。

大量的研究发现，冬凌草甲素可以从多条通路诱导肿瘤细胞凋亡［6］，生物个体是一个整体，细胞内信号通路交织成复杂网络，相互调节是常见机制，具体的凋亡程序还需要进一步研究。如何更准确地抑制该信号通路，如何筛选更为合适的靶向药物以及存在的安全问题都是应当考虑的，有待更深入的研究。

［1］ Jemal A,Bray F,Center MM,et al．Global cancer statistics．CA:a cancer journal for clinicians,2011,61(2):69-90．

［2］ 刘淑云,谭英姿,范明松,等．冬凌草甲素研究进展．中国当代医药,2012,19(13):17-18．

［3］ 刘建国．乳腺癌的致病因素及治疗原则．中国社区医师,2012,14(5):48．

［4］ 潘凌霄,郑文博,高进．乳腺癌的综合治疗．求医问药(学术版),2012,10(2):270．

［5］ 贾臻,胡夕春．乳腺癌的药物治疗进展．药品评价,2012,9(6):4-7．

［6］ 金星镜,丁文评,张莲,等．冬凌草甲素对人结肠癌细胞株HCT116生长的影响及其机制研究．现代生物医学进展,2014, 14(23):44-46

Objective To cultivate Bcap-37 cells of breast cancer through aseptic manipulation in vitro，observe the infl uence of oridonin on the activity and apoptosis of Bcap-37 cells，and explore anti tumor mechanism of oridonin. Methods Axenic cultivation of Bcap-37 cells，set the concentrations of oridonin by 0，1，2，4，8，16，32，64ug/ml respectively，after 12，24，36，48 hours，detect the inhibition of oridonin to Bcap-37 cells activity by MMT method；set the concentrations of oridonin by 8 ug/ml，32ug/ml，24 hours later，use fl ow cytometry to detect the effect of apoptosis on Bcap-37 Cells by oridonin. Results Oridonin has the effect on inhibiting the proliferation and inducing apoptosis of Bcap-37 cells. Conclusion Oridonin can inhibit the proliferation of Bcap-37 cells and induce the apoptosis of Bcap-37 cells，thus providing a new reference for the clinical treatment of breast cancer.

Oridonin Bcap-37 cells Apoptosis

浙江省中医药科技计划项目（2016ZB038）；浙江中医药大学校级科研基金项目（2015ZY10）

310000 浙江中医药大学附属第一医院

*通信作者