高玮岐++董玉瑛++汪皓琦++邹学军

摘要：以明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）为受试生物，研究3种水体常见的喹诺酮类抗生素（QNs）对其的单一毒性和联合毒性作用，并基于毒性单位法、相加指数法和混合毒性指数法等联合作用评价方法，对混合体系的联合毒性作用类型进行分析。结果表明，不同的评价方法对3种QNs的联合效应评价结果具有较好的一致性，联合毒性作用类型均表现为不同程度的拮抗作用。根据发光菌发光原理和QNs分子结构不同，可对联合毒性作用的机理进行初步探讨。多种QNs混合体系的联合毒性作用呈现出以拮抗效应为主，揭示了此类医药品在环境中联合使用时可导致药效的降低或引发微生物耐药性的传播。

关键词：单一毒性；联合毒性；明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）；喹诺酮类抗生素；评价

中图分类号：X503.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）16-3074-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.16.018

The Toxicity of the Common Quinolones in Water Body to Photobacterium phosphoreum

GAO Wei-qi， DONG Yu-ying， WANG Hao-qi， ZOU Xue-jun

（College of Environment and Resource，Dalian Nationalities University， Dalian 116600，Liaoning，China）

Abstract： The single toxicity and joint toxicity of three quinolones common detected in the aquatic environment were studied on Photobacterium phosphoreum. The joint toxicity was evaluated by toxicity unit，additive index and mixtures toxicity index. The results of three evaluating methods had good consistency. It suggested that the antagonisms of various extents appeared among the mixture systems. Mechanisms of joint toxicity were preliminary analyzed by luminescence principle of P. phosphoreum and the characteristics of quinolones molecular structure. The facts that mixture systems showed almost antagonism could reveal that joint toxicity in the environment may increase pharmaceutical action or induce the spread of antibiotic resistance.

Key words： single toxicity； joint toxicity； Photobacterium phosphoreum； quinolones； evaluation

喹諾酮类抗生素（QNs）在治疗人和动物细菌性感染方面具有良好的临床效果，应用广泛，其需求及使用量大，据统计，2010年氟喹诺酮类药物占据全球抗生素15%的市场份额[1]，而抗生素进入人或动物体内后40%～90%以母体或代谢物的形式随排泄物进入环境[2]，其环境残留对水生生物、植物生长发育等产生明显的危害或潜在的负面影响，当前水体已成为环境中抗生素重要的归宿地，多种QNs具有较高的检出水平[3-5]。环境中抗生素的暴露特征体现在混合、持久和低剂量等方面，因其产生的联合毒性对水生生物及水环境系统会带来很大风险[6]。单一QNs的生物学效应研究显然不能满足现实中水体的特点，QNs生态毒性机理的研究以及与其他环境污染物的联合毒性效应值得重视[7，8]。

结合生物发光细菌应用范围广、灵敏度高、相关性好、反应速度快等优点[9]，本试验以加替沙星、洛美沙星和左氧氟沙星3种喹诺酮类抗生素为研究对象，将明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）作为指示物，测定3种抗生素对发光菌发光抑制的半数效应浓度（EC50）和不同混合体系的EC50，并采用毒性单位法、相加指数法、混合毒性指数法等联合毒性评价方法对联合毒性作用类型进行评价。

1 试验部分

1.1 试剂与仪器

加替沙星片和盐酸左氧氟沙星胶囊（江苏苏中药业集团股份有限公司）、盐酸洛美沙星片（江苏黄河药业股份有限公司），用3%NaCl溶液配制相应的系列浓度梯度，待用。试验所用试剂均为分析纯。

DXY22型生物毒性测试仪（中国科学院南京土壤研究所）、8522型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器厂）、THZ282气浴恒温振荡器（江苏金坛仪器厂）、DHP29082型电热恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）、LDZX240CI型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、不同量程的精密移液器（Thermo公司）、SJH型洁净工作台（沈阳市净化仪器厂二分厂）、常规玻璃仪器。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的培养 工作菌液的制备：吸取一定量培养好的摇瓶菌液于3%NaCl溶液中，充分搅拌，稀释程度以控制空白（由2 mL的3%NaCl溶液和0.1 mL的工作菌液组成）发光强度在300～800 lx为宜。明亮发光杆菌冻干粉购自中国科学院南京土壤研究所微生物室。有关发光菌冻干粉的复苏、斜面菌种的培养、摇瓶菌液的培养、工作菌液的制备等操作方法见文献[10]。endprint

1.2.2 急性毒性EC50的测定 ①预试验。选定浓度梯度进行试验，观察15 min发光菌的发光抑制率，确定试验浓度范围。②单一毒性EC50的测定。在预试验基础上，将待测化合物配成适当的6个浓度梯度，各取不同梯度的溶液2 mL加入具塞磨口比色管（15 cm，H 6 cm）中，以2 mL 3%NaCl溶液作空白对照，取0.2 mL工作菌液于各比色管中，加塞上下振荡均匀，去塞，暴露15 min，测定发光强度。每个浓度梯度设3组平行，保证标准偏差低于10%。③联合毒性EC50的测定。按等浓度比（mg/L）配制加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星的二元及三元混合体系，根据预试验结果设6个浓度梯度（半数抑制率附近），测定混合体系对发光菌的联合毒性EC50，试验步骤与单一毒性EC50测定相同，控制3组平行的试验标准偏差低于10%。

1.2.3 数据处理 鉴于污染物浓度与其对应发光抑制率的关系在EC50附近呈良好的线性分布，故本试验采用Excel绘图软件，将化合物浓度（x）和相对抑制率（y）进行回归分析，求得线性回归方程，y（发光抑制率）=ax（化合物浓度）+b。根据线性回归方程求出发光抑制率为50%时所对应的化合物浓度，即为化合物单独作用时EC50。化合物浓度和死亡率之间的相关系数R，经显著水平检验，置信区间范围大于95%；反之，需重新测定。

发光抑制率=×100%

1.2.4 联合毒性评价方法 当多种有害因素危害机体时，可以产生独立、相加、协同和拮抗4种作用类型。常用于联合毒性评价的方法有毒性单位法、相加指数法、混合毒性指数法等[11]。各类评价指数的评价标准见表1。

2 结果与分析

2.1 单一毒性作用分析

3种QNs（加替沙星、左氧氟沙星和洛美沙星）对发光细菌的急性毒性测试曲线见图1。曲线表征的是典型的毒性浓度—效应关系，其效应关系较为清晰，从图1可以看出，3种医药品对发光菌发光强度的抑制曲线均呈单调非线性递增趋势。

3种化合物加替沙星、洛美沙星和左氧氟沙星对发光菌有不同程度的抑制作用，EC50分别为8.4×10-5、13.7×10-5和12.9×10-5 mol/L。根据其EC50的大小，判断抑制作用强弱为加替沙星>左氧氟沙星>洛美沙星，即加替沙星的生物毒性最大，环境风险也最大，以下依次是左氧氟沙星和洛美沙星。从结构上看，3种QNs母环相同，各自取代基的种类和数量皆不同，可见影响医药品毒性的因素来源于取代基。翟丽华[12]选取17个部分取代苯化合物对发光菌的急性毒性研究得出取代基对发光菌的毒性贡献大小顺序为-NO2>-Cl>-CH3>-NH2>-OH。李晓等[13]研究10种苯并噻唑类污染物对青海弧菌Q67毒性效应得出各取代基对青海弧菌毒性排序为巯基取代>氨基>2羟苯基>羧酸乙酯>溴>氟>甲基>氯>甲硫基>苯并噻唑。上述试验结论均是在各同系物取代基单一的情况下取得，对本试验有借鉴参照的意义。如需获得各取代基对药物的毒性贡献则需要对更多相关试验结果加以分析及分子相互作用机制的理论支持。

2.2 二元混合体系联合毒性分析

将3种化合物按等毒性比例配成二元混合体系，其混合体系的联合毒性作用见表2。由表2可知，等毒性比例混合时，3组二元混合体系均表现出拮抗作用。根据3组二元混合体系的MTI和AI的不同，可判断其拮抗作用的强度有所不同，由此获得不同体系拮抗作用的排序为加替沙星+洛美沙星﹥加替沙星+左氧氟沙星﹥左氧氟沙星+洛美沙星。

2.3 三元混合体系联合毒性分析

将3种化合物按等毒性比例配成三元混合体系，其混合体系对发光菌的EC50及联合毒性作用类型见表3。二元混合体系联合毒性类型均表现为拮抗作用，由此分析，3种喹诺酮类抗生素分子间的相互作用导致体系联合毒性降低，多个二元拮抗體系累加，分子间相互作用增强，导致多元混合体系呈拮抗作用。由表3可知，等毒性比例混合时，三元混合体系表现出拮抗作用，且拮抗作用较强，试验结果符合分析，多元混合体系联合毒性作用类型表现为拮抗效应是各拮抗体系累加的结果。方章顺等[14]研究典型抗生素与群体感应抑制剂对费氏弧菌的三元慢性联合毒性时证明混合体系为拮抗效应，是其中两个较强的拮抗体系叠加的结果。任皓等[15]研究盐酸吉他霉素与金霉素、盐霉素、黄霉素对发光细菌联合毒性作用时，在多个混合体系得到相似结论，表明体系中拮抗作用表现较强的分子混合体系起主导作用。此外试验得多元混合体系均表现为拮抗作用，可见医药品在环境中，经过各途径混合后，其相互作用可能导致毒性减弱，以及微生物耐药性的产生和传播，致使微生态平衡遭到破坏。

3种评价方法对二元或多元混合体系的联合毒性评价结论一致，均为拮抗作用，表明3种评价方法具有良好的一致性，其中相加指数法所得数值绝对值最大，参数物理意义较明确，评价结果便于理解。孟庆俊等[11]对苯胺及硝基苯胺的二元混合体系运用毒性单位法、相加指数法、混合毒性指数法等进行联合毒性的评价，结果具有良好的一致性，均为较强的拮抗作用。董玉瑛等[10]采用毒性单位法、加和指数法、混合毒性指数法和相似性参数法4种评价方法对SDS、苯酚、甲苯、硝基苯的多元混合体系进行联合毒性作用类型评价，结果较为一致，均为协同作用，且联合毒性强弱评价结果呈现出一致的顺序。

2.4 毒性作用机制的初步探讨

二元及三元混合体系联合毒性作用皆为拮抗效应，对于呈现的联合毒性作用效应，可从喹诺酮类抗生素不同取代基的特性及其相互作用、发光杆菌发光原理进行初步的联合毒性机理分析。

大部分发光细菌发光机制是基本相同的，都必须有细菌荧光素酶（LE）、还原性的黄素单核苷酸（FMNH2）、氧气（O2）、长链脂肪醛（RCHO）的参与，大体发光反应过程如下[10]：

试验中3种药品存在较大电负性、含孤电子对的元素（F、O、N），他们所在的基团氨基（-NH2）、羟基（-OH）等都易与黄素单核苷酸结合形成氢键，阻碍或阻止FMNH2在氧化和还原形式之间的氢传递，抑制发光[10]。结合本试验3种QNs联合毒性作用类型，拮抗作用引起发光杆菌发光变化是由于在反应中，还原态的黄素单核甘酸（FMNH2）被氧化成黄素单核甘酸（FMN）的过程中起到了传递氢的作用，加替沙星、洛美沙星和左氧氟沙星的分子中均含有N元素，对于FMNH2而言是一种营养元素，可在一定程度上促进氢的传递，进而降低发光的抑制程度，表现为拮抗作用。进一步结论还需要对药物联合毒性作用机制以及发光菌生理生化反应等进行深入研究。在此基础上可开展QNs四元及以上多元混合体系的联合毒性作用类型的研究，同时运用建模等手段辅助研究。endprint

3 小结

本试验主要研究了3种QNs对发光菌的急性单一及联合毒性。①3种QNs单一毒性由强到弱的顺序依次为加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星。由此推断其单一毒性可能与其化学结构有关。②二元、三元体系QNs联合毒性皆呈现出不同程度的拮抗作用，此类医药品在环境中的联合使用可能导致混合毒性减弱，造成微生物耐药性的产生和传播，影响微生态的平衡。③3种评价方法表现出良好的一致性，都是评价联合毒性可行的方法，其中以相加指数法获得参数绝对值较直观，判定灵敏度较高。

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