陈鑫珠， 张建国

(1.华南农业大学草业科学系/广东省草业工程技术研究中心， 广东 广州 510642； 2.福建省农业科学院畜牧兽医研究所， 福建 福州 350013)

随着畜牧业的发展，青贮饲料已成为反刍动物日粮中不可缺少的常规饲料。常规的青贮主要是以新鲜的牧草、饲料作物等作为原料，利用其表面附着的乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)厌氧发酵来保存饲料营养的一项技术。青贮是一个非常复杂的微生物活动和生物化学变化过程，受许多因素的影响，但起主导作用，并决定青贮成败的关键微生物是乳酸菌。牧草表面附着大量的微生物，乳酸菌仅占极少的一部分。张慧杰[1]报道，未收割的饲草表面主要附着有产气单胞菌属(Aeromonas)、紫色杆菌属(Janthinobacterium)、纤维杆菌属(Cellulomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和黄单胞菌属(Xanthomonas)的革兰氏阴性菌等。Cai等[2]从黑麦草(LoliummultiflorumL)和苜蓿(MedicagosativaL.)中分离到植物乳杆菌(L.plantarum)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、乳酸片球菌(P.acidilactici)、粪肠球菌(E.faecalis)、类肠系魏斯特菌(W.paramesenteroides)、假肠膜明串珠菌(L.pseudomesenteroides)6个株菌，将其分别添加到青贮料中，发现与粪肠球菌、类肠系魏斯特菌和假肠膜明串珠菌相比，乳酸片球菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌能够更有效地提高青贮的发酵品质。保安安[3]研究了青藏高原不同地区垂穗披碱草(ElymusnutansGriseb.)青贮饲料中乳酸菌多样性及优势菌种的发酵特性，发现不同地区、不同气候条件下，乳酸菌的种类和数量存在明显差异。牧草从刈割到青贮填装过程中，由于刈割、切短等物理性创伤造成汁液的大量流出，为微生物的生长提供良好条件[4]。McDonald等[5]也曾报道，完整健康的植株存在着很少量的乳酸菌，在植株收获时受到机械损伤，或者在鲜嫩植株或果实腌制过程中，由于受损伤的植物体组织渗出汁液提供营养，乳酸菌的种类和数量才会有较大的变化；另外，花、果实和植株的受伤部位菌数也较多。目前已有研究报道青贮发酵过程中乳酸菌的动态变化，但从牧草刈割到青贮填装阶段乳酸菌数量和种类已发生变化，而相关的研究报道较少。因此，本研究以甜玉米(ZeamaysL.)和热研四号王草(Pennisetumpurpureum×P.americanum‘Reyan No.4’)为材料，记录从刈割到放置24 h阶段乳酸菌的变化情况，为今后青贮添加剂的利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

甜玉米(ZeamaysL.)和热研四号王草(Pennisetumpurpureum×P.americanum‘Reyan No.4)种植于华南农业大学增城宁西试验基地，采集时距地面10 cm无菌割取，装入封口袋，4℃冰盒中冷藏，带回实验室立即分析。

1.2 试验设计

本试验设计4个阶段研究材料从刈割到青贮填装前乳酸菌的动态变化，分别为刈割、切短、放置8 h和放置24 h，具体如表1所示。

表1 试验设计Table 1 Design of experiments

1.3 分析方法

原料分析样本放置105℃烘箱杀青30 min后，置65℃烘箱干燥48 h测得干物质(dry matter，DM)含量[6]；缓冲能(buffer capacity，BC)的测定采用盐酸、氢氧化钠滴定法[7]；粗蛋白(crude protein，CP)含量采用凯氏定氮法测定[6]；可溶性碳水化合物(water soluble-carbohydrate，WSC)含量采用Anthrone比色法定量[8]，同时取10 mL浸提液，在浸提液中加入少量阳离子交换树脂，在14 000 r·min-1下离心5 min后，0.22 μm微孔滤膜过滤，利用高效液相色谱仪测定棉子糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、木糖、半乳糖和果糖，色谱条件：色谱柱(SUGAR P0810，日本)，流动相为超纯水，流速0.8 mL·min-1，柱温75℃，检测器为RID-10A紫外检测器。

1.4 乳酸菌的鉴定

乳酸菌的样品分离与纯化参考张慧杰[9]的方法进行，形态学和生理生化特性检测参考凌代文和东秀珠[10]的方法进行。

需鉴定的菌株在4 mL的MRS培养基中30℃培养18 h，取菌液1.0 mL移入1.5 mL的离心管中，14 000 rpm·min-1离心3 min收集菌体，再用TE(10 mmol·L-1Tris-HCl, 0.1 mmol·L-1EDTA, pH 8.0)清洗两次，参照Dongsheng Bacteria DNA Kit(东盛生物科技有限公司，广州，中国)试剂盒提取乳酸菌的全长DNA。

乳酸菌菌株的16S rRNA 序列扩增参照张慧杰[9]方法进行，扩增后的PCR产物送华大生物科技有限公司(中国，广州)测序，获得16S rDNA序列信息后与GeneBank基因库中16S rDNA序列进行比较。将测序结果与标准序列在MEGA5软件中进行序列同源性比对，构建系统发育树，确定其在发育树中的位置，从而对乳酸菌进行种属归类。

1.5 数据统计分析

用Excel对数据进行整理，采用SPSS 17.0软件对数据进行分析，采用Duncan中的one-way方法进行单因素方差分析。测序所得的序列递交到GeneBank，用Blast来找寻预期有最大同源性的序列。测序菌株的序列与标准菌株之间的16S rDNA同源性值大于98%，一般可判定他们属于同一种。

2 结果与分析

2.1 不同阶段甜玉米和热研四号王草特性变化

甜玉米秸秆从未切短到放置24 h 其DM、CP和WSC含量，pH值、LAB、细菌和霉菌的数量有显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)的变化。未切短材料CP和WSC含量显著(P<0.05)高于其他3个阶段，pH值显著(P<0.05)低于其他3个阶段；放置24 h后，DM显著(P<0.05)升高，LAB、细菌和霉菌的数量显著(P<0.05)增加；放置8 h到24 h阶段DM含量和细菌数量升高最显著(P<0.05)，CP、WSC含量，未切短到切短阶段pH值变化最显著(P<0.05)，切短到放置24 h阶段霉菌的数量增加最显著(P<0.05)(表2)。

表2 不同阶段甜玉米特性变化Table 2 The changes of characteristics of Zea mays L. at different stages

注：同行不同小写字母表示差异显著；**P<0.01，*P<0.05，下同

Note: Different lowercase letters in the same row indicate significant difference; ** and * indicate significant difference at the 0.01 and 0.05 level, respectively. The same as below

热研四号王草从未切短到放置24 h 其DM、WSC、半乳糖和果糖含量，pH值、缓冲能、LAB和霉菌的数量有显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)的变化。未切短材料WSC含量显著(P<0.05)高于其他3个阶段，LAB和霉菌的数量显著(P<0.05)低于其他3个阶段；放置24 h后DM、半乳糖和果糖含量、pH值、缓冲能显著(P<0.05)高于其他3个阶段；放置8 h到24 h阶段DM、半乳糖和果糖含量、pH、缓冲能显著升高(P<0.05)，未切短到切短WSC含量、LAB和霉菌的数量变化显著(P<0.05)(表3)。

表3 不同阶段王草特性变化Table 3 The changes of characteristics of Pennisetum purpureum×P.americanum‘Reyan No.4’at different stages

2.2 乳酸菌多样性

甜玉米和热研四号王草从未切短到放置24 h 4个阶段，每个阶段分离15株菌株，共分离120株菌株，经革兰氏染色、生理生化特性分析、16S rDNA分析确定80株为乳酸菌。4个阶段乳酸菌种类没有明显变化，均分离到植物乳杆菌、乳酸乳球菌和融合魏斯氏菌；甜玉米3种菌从未切短到放置24 h所占比例变化不大(20.00%～22.22%，22.22%～30.00%，30.00%～55.56%)，热研四号王草中乳酸乳球菌、融合魏斯氏菌和柠檬明串珠菌比例有增加的趋势(16.67%～40.00%，8.33%～30.00%， 8.33%～20.00%)；热研四号王草4个阶段都分离到 柠檬明串珠菌和粪肠球菌，而甜玉米在新鲜材料中未分离到柠檬明串珠菌；在放置24 h阶段中分离到10%的假肠膜明串珠菌，热研四号王草在新鲜材料中分离到16.67%的短乳杆菌 (表4，5)。

表4 不同阶段甜玉米乳酸菌种类与数量的变化Table 4 The species composition and variation of LAB on sweet corn at different stages

注：表格中百分比数表示此乳酸菌菌株占此阶段分离得到总乳酸菌菌株数的百分比

Note: Data in the table mean the percentage of LAB strains to the total LAB strains

表5 不同阶段王草材料乳酸菌种类与数量的变化Table 5 The species composition and variation of LAB on king grass at different stages

3 讨论

饲草青贮的效果取决于主导发酵过程的优势乳酸菌的种类和数量，研究饲草中优势乳酸菌种类、数量和特性对于预测青贮质量、开发乳酸菌青贮添加剂和调控青贮发酵有极其重要的意义[15]。在无外源乳酸菌添加条件下，青贮主要是依靠原料本身附着的乳酸菌进行发酵，因此，饲草原料中含有的乳酸菌种类、数量和活性会影响青贮饲料的发酵品质[16]。司丙文等[17]研究山竹岩黄芪(HedysarumfruticosumPall.)青贮中优质乳酸菌的分离和鉴定，分离获得3株同型发酵乳酸菌，分别为蒙氏肠球菌(Enterococcusmundtii)，乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactissubsp.Lactis)，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。崔棹茗等[16]在青藏高原青稞秸秆中分离出了3种同型发酵乳酸菌菌株，分别为植物乳杆菌(Lactabacillusplantarum)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。本试验发现4个阶段乳酸菌数量均有增加，杆菌(Lactobacillusplantarum)比例变化不明显，但球菌(Leuconostoccitreum、Weissellaconfusa和Enterococcusfaecalis)的比例明显增加。这与Cai等[18]报道的发酵前牧草中的乳酸菌主要为球菌，乳酸杆菌的数量极少的结果相似。

Ercolani[19]报道，对于同种植物，种植在距离相近的不同地区和时间以及不同的生长季节，附生细菌的数量、规模也会不同。这些种群规模的差异在很大程度上是由叶际的生理特性和营养条件的波动造成的。刘长建[2]表明植物受伤部位汁液流出，为表面微生物提供营养，会产生大量微生物的聚集。本研究发现4个阶段乳酸菌的种类与数量均有变化，有的菌种数量剧增，而有的菌种在某个阶段出现或消失；从未切短到切短过程中，乳酸菌的种类和数量变化最大。不同牧草变化情况也不同，甜玉米切短后分离到柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)，放置24 h后分离到假肠膜明串珠菌(Leuconostocpseudomesenteroides)；热研四号王草切短后短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)消失。说明切短后植物受到损伤，大量营养物质流出，能够为乳酸菌的生长繁殖提供足够的养分，从而造成某些种类乳酸菌的大量繁殖。由于植物组织受伤处提供更多的养分，乳酸菌在短时间内能够快速大量的生长繁殖，这种数量上的增加在切短或划破时会更加显著[3]。

4 结论

综上所述，乳酸菌的种类和数量变化最大的阶段是在植物从未切短到切短阶段；其中杆菌(植物乳杆菌Lactobacillusplantarum)比例变化不明显，但球菌(柠檬明串珠菌Leuconostoccitreum、融合魏斯氏菌Weissellaconfusa和粪肠球菌Enterococcusfaecalis)的比例明显增加。放置时间延长，乳酸菌种类和数量也会有较大变化，不同的植物表现不同，甜玉米切短后分离得到柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)，放置24 h后分离得到假肠膜明串珠菌(Leuconostocpseudomesenteroides)；热研四号王草切短后短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)消失。