马甲强， 袁庆华， 王 瑜， 苗丽宏

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所， 北京 100193； 2. 广元市林业和园林局 城市园林绿化管理处， 四川 广元 628000)

苜蓿(Medicago)是多年生优质豆科牧草，也是我国种植面积最大的人工牧草。其具有产量高、品质优和适口性好等特点，他不仅能改良土壤，还可以提高家畜生长性能[1-2]。近几年来，随着苜蓿种植面积的不断扩大和单一品种的连作，苜蓿炭疽病危害加重。本课题组在2013-2015年对东北和华北苜蓿地病害调查时发现，苜蓿炭疽病平均发病率达42.3%，造成的产量损失率达10.1%～54.4%。因此，该病的防治对苜蓿生产非常重要。防治的关键是筛选和培育抗苜蓿炭疽病品种。据国内外文献报道[3-4]，引起苜蓿炭疽病的主要病原菌有三叶草刺盘孢(Colletotrichum.trifolii)、毁灭刺盘孢(C.destructivum)和平头刺盘孢(C.truncatum)。2014年Vasic等[5]在塞尔维亚首次发现一种由亚麻刺盘孢(C.linicola)引起的苜蓿炭疽病。同年本课题组在我国吉林、内蒙古苜蓿上也发现此菌，且致病性较强。近年来，国外对其他病菌引起的苜蓿炭疽病的抗性品种筛选进行了大量研究，并筛选出一些优良品种材料[6-7]。在国内，苜蓿炭疽病的抗性评价研究较少，缺乏抗性种质材料比较研究。郑芳芳等[8]以苜蓿的病叶量作为测定指标鉴定了20个苜蓿品种对炭疽病(C.truncatum)的抗性。而关于此菌引起的苜蓿炭疽病的抗病性评价在国内外尚属空白。因此，本研究通过对50份苜蓿种质材料进行苗期室内接种评价，通过统计病情指数，测定株高、生物量形态指标，测定相对质膜透性、脯氨酸含量、可溶性糖含量和木质素含量等生理生化指标，并以病情指数进行直接抗性评价；同时通过主成分分析筛选出与抗病性鉴定密切相关的4个主要指标，并采用隶属函数分析法对50份苜蓿种质进行综合评价。通过这两种方法筛选出可靠的具有较强抗性的苜蓿种质材料，为苜蓿炭疽病的防治和抗病育种材料的选育提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试50份苜蓿种质材料均由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牧草资源室提供，种子名称及来源如表1所示。

表1 种质材料及来源Table 1 The alfalfa germplasm materials and their sources

注：-表示种质来源地不详；* 表示无原种名或原种名不详,下同

Note: - indicate the germplasm sources are unspecified; * indicate the original name of this germplasm source is unknown,The same below

供试菌株为亚麻刺盘孢(Colletotrichumlinicola)，由吉林省白城苜蓿中分离获得，菌株接种于PDA培养基上，4℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1苜蓿幼苗的培育 将沙土和草炭按照1∶1混合在高压灭菌锅中灭菌30 min，装在套有塑料袋的花盆(高15 cm，口径16.5 cm，底径11 cm)中，每盆装混合土2 kg。种子用0.1%的升汞溶液消毒3 min，再用蒸馏水冲洗3次后放在培养皿中，置于25℃的恒温培养箱中黑暗培养72 h，然后将发芽的种子移栽到花盆中，每盆15株，待生长到2～3片真叶时定植，每盆保留10株。花盆放置在20～25℃温室中培养，每隔2 d浇一次水。设置接种处理与不接种对照两组，3个重复。

1.2.2菌种培养及接种 将已保存的菌株在25℃下PDA平板上活化培养10 d。并收集菌落制成孢子悬浮液，用血球计数板计数，稀释孢子悬浮液浓度为1×106个·mL-1。用喷雾接种法[8]接种在生长60 d的苜蓿上，并用塑料薄膜密封黑暗保湿48 h，之后将苜蓿放置在光照16 h，25℃，黑暗8 h，23℃下培养。

1.2.3测定指标及方法

1.2.3.1 病情测定方法 依据苜蓿苗期接种14 d出现发病高峰，14 d后进行病情统计(下同)，病情分级标准如下：

0：无病斑；1：病斑占叶面积6%或以下；2：病斑占叶面积6%～25%；3：病斑占叶面积26%～45%；4：病斑占叶面积46%～65%；5：病斑占叶面积66%～75%；6：病斑占叶面积76%以上。

根据病情指数[9]将50份苜蓿种质材料抗病性划分为四个等级：病情指数小于11的为高抗；11～25之间的为中抗；25～35之间的为中感；大于35的为高感。

1.2.3.2 株高 用直尺测定每株幼苗的垂直高度，每盆测定5株，共测定3盆，以15株幼苗株高平均值作为株高，为了减小试验材料本身误差，用相对株高[10]作为抗病性衡量指标。

1.2.3.3 产量损失率测定[11]用剪刀齐地剪取苜蓿地上部分，放置在105℃的烘箱中杀青(30 min)，85℃下烘干至恒重(48 h)，待冷却至室温后称重(精确到0.000 1 g)，3盆苜蓿植株地上部分生物量干重的平均值作为地上生物量干重。

1.2.3.4 脯氨酸含量测定 采用茚三酮测定法[12]，称取0.5 g苜蓿新鲜叶片，分别加入10 mL 3%磺基水杨酸溶液，迅速研磨成匀浆，移至50 mL离心管中沸水浴10 min，放置室温后，3 000 r·min-1离心10 min。取上清液2 mL于15 mL带塞试管中，再分别加入2 mL 3%磺基水杨酸，2 mL冰醋酸和4 mL 2.5%酸性茚三酮，沸水浴中显色1 h。冷却后，再加入4 mL甲苯，漩涡震荡0.5 min，静置分层。用移液枪吸取红色甲苯相2 mL，520 nm处测定其OD值。

1.2.3.5 可溶性糖含量测定 采用蒽酮法[12]测定。称取0.2 g苜蓿新鲜叶片，剪碎置于具塞试管中，加10 mL蒸馏水，在沸水中提取1 h，将提取液过滤入25 mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣并定容至刻度。吸取0.5 mL提取液，然后加入1.5 mL蒸馏水，再按顺序依次向试管加入蒽酮乙酸乙酯0.5 mL和浓硫酸5 mL，充分振荡，立即放入沸水浴1 min，取出冷却至室温，用分光光度计在630 nm波长下测其吸光度。

1.2.3.6 质膜相对膜透性 采用电导法[12]测定。称取0.5 g苜蓿新鲜叶片，用自来水冲洗后再用蒸馏水冲洗2次，用滤纸吸干后剪碎混匀，浸泡于装有20 mL水的50 mL带塞试管中4 h，用DDS-Ⅱ型电导仪测定其电导率。然后置于沸水浴30 min，冷却至室温再测其电导率，记录数据。以相对电导率表示细胞质膜透性大小。

1.2.3.7 木质素含量测定 采用紫外分光光度法测定[13]方法，略有改进。称取新鲜叶片0.5 g放入研钵中，加5 mL 95%的乙醇研磨成匀浆，收集在10 mL离心管中，8 000 r·min-1离心10 min并收集沉淀。用95%乙醇洗涤沉淀3次，再用乙醇∶正己烷(1∶2)冲洗3次，收集沉淀干燥5 h。然后用0.5 mL 25%的乙酰溴冰乙酸溶液溶解，并置于70℃水浴中加塞保温30 min，再用0.9 mL 2 mol·L-1NaOH终止反应，依次加入5 mL的冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol·L-1的盐酸羟胺，振荡混匀，8 000 r·min-1离心5 min，吸取上清液0.1 mL，加入3.0 mL的冰醋酸稀释后，测定每克的吸收波长A280 nm，以此表示木质素的含量。

1.3 数据分析

采用Excel(2013)软件处理数据，用SPSS 19.0，SAS 8.0软件分别进行方差分析、主成分分析和隶属函数分析。

隶属函数的计算公式：R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

反隶属函数值计算公式：R(Xi)=1 -(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中，Xi为指标的测定值；Xmin、Xmax为所有参试材料某一指标的最小和最大值。

2 结果分析

2.1 供试苜蓿种质材料抗亚麻刺盘孢的直接评价

各苜蓿种质对炭疽病的抗性存在极显著的差异(P<0.01)，各材料之间表现出不同的抗病性(表2)。病情指数为3.17～37.45，其中病情指数小于11的种质材料有9份，分别是兰热来恩德(M 5)、干地(M 22)、呼伦贝尔(M 13)、吐鲁番(M 18)、霍纳伊(M 33)、阿尔贡奎因(M 14)、龙牧801(M 19)、杜普梯(M 28)和西奎尔(M 16)，为高抗材料，占供试材料的18%；病情指数在11～25之间中抗材料有21份，占供试总材料的42%；病情指数在25～35之间的中感材料有14份，占供试总材料的28%；而病情指数大于35的高感材料有6份，分别是新疆大叶(M 39)、法国(M 47)、榆次(M 43)、南特(M 6)、沧州(M 50)和普罗莫(M 10)，占供试总材料的12%。可见大部分材料对苜蓿炭疽病属于中等抗性材料。

2.2 供试苜蓿种质材料抗亚麻刺盘孢的间接评价

2.2.1各苜蓿种质接种亚麻刺盘孢后的相对株高 接种亚麻刺盘孢后，不同程度的抑制了各种质材料的株高(表2)。各种质材料的相对株高存在极显著差异(P<0.01)，相对株高的变化范围为94.81%～51.17%，其中相对株高在90%以上的种质材料有4份，分别是龙牧801(M 19)、吐鲁番(M 18)、阿佩克斯(M 21)和阿尔贡奎因(M 14)，占供试材料的8%；相对株高在70%以下的种质材料有5份，分别是萨兰斯(M 17)、法国(M 47)、P-23(M 36)、C/W3(M 38)和新疆大叶(M 39)，占供试材料的10%；而大部分种质材料的相对株高集中在70%～90%之间，共有41份，占供试材料的82%。

2.2.2各苜蓿种质接种亚麻刺盘孢后的产量损失 由表2可知，接种后各种质材料产量均有降低，且各种质材料的产量损失率差异显著(P<0.05)，产量损失率变幅范围为6.70%～59.11%，产量损失率达40%以上的材料有8份，分别是新疆大叶(M 39)、陇东(M 1)、纳拉甘塞(M 40)、普罗莫(M 10)、法国(M 34)、南特(M 6)、沧州(M 50)和榆次(M 43)，占供试材料的16%，其中新疆大叶产量损失率最高，达59.11%；产量损失率在15%以下的有7份，分别是兰热来恩德(M 5)、吐鲁番(M 18)、爱若(M 25)、敖汉(M 32)、龙牧801(M 19)、阿尔贡奎因(M 4)和克利来(M 24)，占供试材料的14%，其中兰热来恩德产量损失率最小，仅6.70%；而其他种质材料产量损失率在15%～40%之间，共计35份，占供试材料的70%。由此可见，亚麻刺盘孢对种质材料的产量损失影响较大。

2.2.3各苜蓿种质接种亚麻刺盘孢后的相对质膜透性 接种后各材料电解质渗出率存在极显著差异(P<0.01)(表2)，相对电解质渗出率变化范围为0.49～1.01。其中陇中(M 26)相对电解质渗出率增幅最大，为1.01，说明陇中(M 26)对苜蓿炭疽病的抗性最差；相对电解质渗出率最小的为兰热来恩德(M 5)，仅为0.49，说明兰热来恩德(M 5)抗炭疽病最强；相对电解质渗出率在0.80～0.98之间的材料有41 份，占供试材料的82%；相对电解质在0.8以下仅有8份，占供试材料的16%。

2.2.4各苜蓿种质接种亚麻刺盘孢后的脯氨酸含量 接种后，各种质材料脯氨酸含量既有升高的又有下降的。各种质材料间相对脯氨酸的含量差异显著(P<0.01)，相对脯氨酸含量在6.63～0.11之间，相对脯氨酸含量大于1的种质材料有27份，其中最高的是霍纳伊(M 33)，为6.63；而其余23份相对脯氨酸含量均小于1，其中克利来(M 24)相对脯氨酸含量最少，仅为0.11。

2.2.5各苜蓿种质接种亚麻刺盘孢后的可溶性糖含量 由表2知，相对可溶性糖含量变化范围为6.72～0.28。各种质材料之间可溶糖含量差异显著(P<0.01)。相对可溶性糖含量大于1的有24份，其中相对可溶性糖含量较高的是榆次苜蓿(M 43)、武功(M 30)和普罗莫(M 10)，分别为6.72，3.71和3.42；可溶性糖含量小于1的有26份，其中敖汉(M 32)相对可溶性糖含量最少，仅为0.28。

2.2.6各苜蓿种质接种亚麻刺盘孢后的木质素含量 各种质材料接种后，木质素含量都有不同程度的升高(表2)。各材料相对木质素含量差异显著(P<0.01)。相对木质素含量变化范围为7.97～1.06，其中相对木质素含量在2以上的有8份，分别是龙牧801(M 19)、奎屯(M 35)、阿尔贡奎因(M 4)、干地(M 22)、中山一号(M 20)、呼伦贝尔(M 13)、霍纳伊(M 33)和兰热来恩德(M 5)，占供试材料的16%，其中龙牧801的相对木质素含量最高，为7.97；木质素相对含量在1.10以下的有美国2号(M 2)、陇东(M 1)和大西洋(M 46)，分别为1.10，1.09和1.06；其余的种质材料相对木质素含量均在1.10～2.00之间。

表2 各苜蓿种质材料的形态指标和生理生化指标Table 2 Morphological, physiological and biochemical indexes of alfalfa materials

注：HR:高抗；R：中抗；S：中感；HS：高感

Note：HR: high resistance; R: moderate resistance; S: moderate susceptibility; HS: high susceptibility

2.2.7主成分分析 将供试50份种质材料的6个相对指标进行主成分分析，计算出各项指标的贡献率，确定综合评价指标，筛选出综合性状好的种质材料。由表3可知，第一、第二、第三和第四主成分方差贡献率分别为41.69%，16.12%，14.98%和11.66%，前四个主成分累计方差贡献率已经达到84.45 %，足以代表整个数据的大部分信息[14]。由表4可知，第一主成分中，产量损失率信息负荷量(特征向量和特征值)最大，可以作为产量损失的评价指标；第二主成分中，相对脯氨酸含量的信息负荷量最大，可作为脯氨酸含量的综合指标。其中，负值说明在主成分中作用效果与其他指标不一致；第三主成分中相对可溶性糖含量的信息负荷量最大，可作为可溶性糖含量的评价指标；第四主成分中相对质膜透性的信息负荷量最大，可作为质膜透性的评价指标。

表3 主成分分析结果Table 3 Results of principal components analysis

表4 各因子载荷矩阵Table 4 Component matrix

2.2.8隶属函数分析 根据主成分分析，筛选出贡献率较大的特征向量：产量损失率、相对脯氨酸含量、相对可溶性糖含量和相对质膜透性4个指标进行隶属函数分析，根据隶函数平均值大小将50份种质材料进行分类。

表5 4个指标的隶属函数值Table 5 The values of subordinate function of four indicates

注：R(1)、R(2)、R(3)、R(4)分别表示产量损失率、相对脯氨酸含量、相对可溶性糖含量和相对质膜透性的隶属函数值；S(1)表示隶属函数平均值

Note：R(1), R(2), R(3), R(4) indicate the subordinate function values of yield loss rate, relative proline content, relative soluble sugar and relative electrical conductivity; S(1) indicate the average values of subordinate function values

根据隶属函数平均值可知：兰热来恩德(M 5)、霍纳伊(M 33)、阿尔贡奎因(M 4)、龙牧801(M 19)、敖汉(M 32)、吐鲁番(M 18)和西奎尔(M 16)隶属函数平均值较大，对苜蓿炭疽病表现为高抗；保加利亚苜蓿(M 44)、法国苜蓿(M 47)、润布勒(M 42)、武功(M 30)、草原三号(M 27)、陇东(M 1)、新疆大叶(M 39)、陇中(M 26)、普罗莫(M 10)、沧州(M 50)和榆次(M 43)隶属函数平均值相对较小，对苜蓿炭疽病表现为高感。

3 讨论

植物的抗病性是一个复杂的生物学过程。接种亚麻刺盘孢后，苜蓿会通过结构抗性和生化抗性抵抗或阻止亚麻刺盘孢菌的接触或侵染[15]。本研究对50份苜蓿种质材料以病情指数进行直接评价和其他指标间接综合评价，来筛选出对亚麻刺盘孢菌抗性较强的品种。通过两种方法的评价，评价结果基本一致，说明两种方法都可用于苜蓿炭疽病的抗性评价。但个别种质材料评价结果不同，导致这种差异的因素可能是抗性鉴定方法不同或种质材料出现隐症现象。然而从苜蓿种质材料的各种指标变幅来看，采用多项指标进行综合评价，其结果更加真实有效。

植物抗病性的评价指标较多[12,16-17]，其中株高和生物量可作为植物抗病性评价的形态指标[10,16]。本试验结果表明，苜蓿幼苗接种亚麻刺盘孢后，50份材料株高均被抑制。抗病性强的种质材料株高比抗病性弱的高，说明苜蓿株高与抗炭疽病成正相关。接种亚麻刺盘孢后，苜蓿产量损失严重，抗病性强的种质产量损失较小，抗病性弱的种质产量损失较大，说明产量损失与种质抗炭疽病呈负相关。从主成分分析来看，产量损失的贡献率最大，可见种质产量损失可作为苜蓿抗炭疽病评价的主要形态指标。

此外，植物被病菌侵染后从细胞壁到细胞内部发生一系列结构抗性反应[20]。众多学者研究发现[19-21]，植株受到病菌侵染后，细胞膜遭到破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，导致电导率增加。李广旭等[22]研究发现轮纹病菌(tryosphaeriaberengrianaf. sp.piricola)侵染苹果(Malusdomestica)后，不同品种的电解质渗出率有不同程度的增大，且感病品种的电解质渗出率大于抗病品种。刘正坪等[23]也认为品种抗病性与细胞膜透性变化呈负相关。本研究发现，苜蓿种质材料接种亚麻刺盘孢后，细胞膜透性均增大，且感病品种的质膜透性大于抗病品种，这与前人研究结果一致。说明细胞膜可作为抗病性评价的指标。木质素含量也呈上升趋势，且抗性品种的含量高于感病品种。说明木质素含量的升高能够有效阻止或延缓病原菌了的侵入。

被病原菌侵染的植物其生理生化机制会发生变化[18]。研究表明，脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗病性[12]。病原菌侵染后脯氨酸含量显著增加，且抗病性强的种质材料游离脯氨酸含量明显高于感病材料[10,24]。本研究发现，接种亚麻刺盘孢后，抗病强的品种脯氨酸含量较低，而感病品种脯氨酸含量较高，这与李银萍等[12]研究不一致，而与王晓宇[25]研究一致。从主成分贡献率来看，脯氨酸含量与品种抗性呈正相关。这可能是因为抗病性强的品种中脯氨酸迅速转化为羟脯氨酸，间接的提高了苜蓿种质的抗病性。植株体内可溶性糖含量与其抗病性的关系研究结果并不一致。有些学者发现可溶性糖含量与植株抗性呈显著正相关[17,26]。也有学者发现可溶性糖含量与植株抗病性呈负相关[27-28]。陈夕军等[27]研究发现，黄瓜抗白粉病品种中可溶性糖含量明显低于感病品种，但接种病原菌后，其含量有下降趋势，而感病品种却有短时上升现象。本试验研究表明，苜蓿种质材料感病后，多数抗病性强的种质可溶性糖含量下降，而感病品种可溶性糖含量上升。由此可见，在一定的程度上，可溶性糖含量与苜蓿种质材料抗炭疽病呈负相关。

4 结论

病害对植物的影响不仅表现在形态指标，还表现在具体的生理生化指标。因此，本研究以统计病情指数4个等级为指标进行直接评价并测定形态指标(株高、生物量)与生理生化指标(相对质膜透性、脯氨酸、可溶性糖和木质素含量)，用主成分及隶属函数分析法进行间接评价，得到了抗炭疽病较强的种质有：兰热来恩德、霍纳伊、阿尔贡奎因、龙牧801、吐鲁番和西奎尔；抗炭疽病较弱的种质材料有：榆次、沧州、普罗莫、新疆大叶和法国(M 47)苜蓿。另外，通过主成分分析筛选出4个与苜蓿苗期抗病性相关的主要指标，分别是：产量损失、脯氨酸、可溶性糖和质膜透性含量。