许冬梅， 张 萍， 柯文灿， 郭旭生

(兰州大学生命科学学院 草地农业生态系统国家重点实验室， 甘肃 兰州 730000)

青贮饲料是用新鲜的青绿饲草在厌氧条件下由乳酸菌经较长时间发酵制成的一种颜色黄绿、气味酸香、柔软多汁、适口性好、消化率较高的饲料，其能为反刍动物在冬春季提供优质的粗饲料[1]。微生物在青贮发酵过程中起到至关重要的作用，参与青贮过程的微生物种类很多，青贮原料上附着的微生物包括有利于青贮饲料发酵的微生物以及引起青贮腐败变质的微生物等，主要有醋酸菌、梭菌、腐败菌、霉菌、酵母菌和乳酸菌等。乳酸菌是青贮发酵过程中起主要作用的微生物[2]，他不仅可以利用原料的可溶性糖发酵产生有机酸尤其是乳酸，降低pH值，还可以通过竞争营养物质及产生细菌素等代谢物质抑制青贮有害菌[3]。但乳酸菌在牧草表面附着的数量远小于好氧细菌[4]。牧草附着的乳酸菌在自然青贮中起重要作用，其数量和组成是决定是否需要接种外源乳酸菌来促进青贮发酵的关键因素[5]。就饲料青贮而言，一个良好的微生物发酵过程是将饲草调制成高品质青贮饲料的关键。而青贮饲料发酵过程的微生态调控是一个难度大但又具有重要学术价值和实践价值的研究课题，长期以来一直都是国内外青贮饲料研究领域关注的热点。因此，了解牧草附着微生物及青贮过程微生物群落组成与演替信息可为有效调控青贮饲料的发酵过程和调制优质的青贮饲料提供科学依据。

1 青贮微生物群落及其在青贮过程中的演替

自然新鲜的牧草表面附着的微生物不管是从组成上还是数量上都与青贮过程中及青贮结束的样品有很大差异，而且附着乳酸菌在萎蔫和切碎的过程中会有所增加[6-7]。Bao等[8]利用三代测序技术研究显示，青贮前后苜蓿样品中检测到的微生物共有超过960种，且青贮前巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)占绝对优势，而青贮后乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)占优势。有利于青贮发酵且在青贮过程中起主导作用的主要是厚壁菌门的乳酸菌，包括乳杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、片球菌(Pediococcus)肠球菌(Enterococcus)及链球菌(Streptococcus)6个属[9-10]，不利于青贮及引起青贮腐败的有好氧性菌、酵母、霉菌和大肠菌类。随着青贮过程的推进，青贮微生物群落结构处在不断变化中。

1.1 牧草表面附着的微生物

植物表面环境对微生物生长具有很大影响，湿度、太阳辐射、植物表面结构、植株营养分布等都是这个环境中影响附着微生物的关键因素[11]。植物表面附着的细菌主要是好氧性菌，真菌主要是酵母和霉菌，还会附着一些放线菌，而有利于青贮发酵的乳酸菌相对来说较少[4, 12]。由于植物表面环境的特殊性，使得不同植物以及同种植物生长在不同环境，其表面附着的微生物在种类和数量上都存在很大差异[13]。

就微生物数量来说，牧草表面附着的乳酸菌为101～106cfu·g-1FM，酵母101～107cfu·g-1FM，霉菌101～106cfu·g-1FM，因不同牧草种类、生长环境和生育期等表现出差异[14-20]。Cai等[21]对同一地点采集的玉米(Zeamays)、高粱(Sorghumbicolor)、苜蓿(Medicagosativa)及意大利黑麦草(Loliummulti·orum)表面附着微生物进行研究，发现这4种牧草表面附着的好氧细菌大概106cfu·g-1FM，肠球菌、明串珠菌、霉菌及酵母为104～105cfu·g-1FM，乳杆菌和片球菌为103cfu·g-1FM；其中高粱和黑麦草表面附着的片球菌只有100.2cfu·g-1FM，苜蓿表面附着的乳杆菌也只有100.2cfu·g-1FM；玉米表面附着的乳酸菌总数是高粱和苜蓿的2倍，是黑麦草的20倍，其结果如表1所示。

表1 不同牧草表面附着微生物种类及数量/ log10 cfu·g-1 FMTable 1 Epiphytic microorganism species and numbers on forages/log10 cfu·g-1 FM

同种牧草表面附着的微生物种类也存在差异，从Cai[18,21]对苜蓿、高粱、黑麦草等表面附着微生物在属水平的研究看出，苜蓿表面附着的乳酸杆菌极少(<101cfu·g-1FM)，而相对来说明串珠菌较多(105cfu·g-1FM)；高粱表面附着的片球菌极少，而乳酸杆菌和肠球菌较多(104～105cfu·g-1FM)。不同牧草表面附着的微生物种类也存在很大差异。有研究表明，阔叶植物上分离到的细菌多样性远高于狭叶植物[13]。Huili Pang等[22]从青贮前的玉米、水稻、高粱及苜蓿样品中分离鉴定了乳酸菌110株，结果表明：玉米表面主要附着的是食窦魏斯氏菌(Weissellacibaria)和融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa)；高粱和水稻表面主要附着植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)；而苜蓿表面主要附着植物乳杆菌、类植物乳杆菌(lactobacillusparaplantarum)及假肠膜明串珠菌(Leuconostocpseudomesenteroides)。

由此可以看出，不同牧草表面附着的微生物种类和数量都有很大的差异，同种牧草生长在不同环境其表面附着的微生物也存在差异。而且牧草不同部位附着的微生物种类和数量也存在差异。例如，Moran等[23]对黑麦草不同部位附着乳酸菌数量研究，结果如图1所示，靠近地面部分及花序附着乳酸菌数量相对较多。

图1 黑麦草不同部位附着乳酸菌数量
Fig.1 Epiphytic lactic acid bacteria on plant parts within ryegrass
注：单位，log10cfu·g-1(±SD)
Note: unit, log10cfu·g-1(±SD)

1.2 青贮过程中微生物的演替

青贮发酵过程中微生物存在动态变化的过程。在这个变化过程中微生物会产生一些代谢产物，其含量会随着青贮过程变化[24]。前人研究显示，开始发酵后的几个小时内牧草本身附着的好氧细菌还处于活跃期，当发酵体系中氧气被消耗完，青贮关键菌中的乳球菌开始大量繁殖并产生乳酸降低体系pH，酵母、霉菌及好氧细菌受到抑制，随着发酵进行，体系pH继续降低，更耐酸的乳酸杆菌代替乳酸球菌主导发酵过程[25-26]。韩吉雨[27]用传统纯培养技术对玉米和苜蓿附着的乳酸菌进行研究，结果显示青贮前期以乳酸球菌较多，随着发酵进行，乳酸杆菌成为优势菌主导青贮发酵过程。Eikmeyer等人[28]用宏基因组学方法研究的结果与前人相似，即随着青贮过程的延长，由乳酸球菌演替为乳酸杆菌，其中一些异型发酵乳酸菌会产生一些挥发性脂肪酸，有利于青贮有氧稳定性及长期保存[29]。

青贮过程中各种微生物的数量也存在变化，整个动态变化过程受原料特性、发酵条件、添加剂等因素影响[30-32]。不同种微生物动态变化过程也存在很大差异。张慧杰[33]的研究显示发酵过程中，乳酸菌数量的最大值为 109.50～1010.38cfu·g-1FM，出现在发酵15天或20天。而一般青贮结束后乳酸菌数量都能达到106～108cfu·g-1FM。

1.3 接种乳酸菌对青贮微生物的影响

由于附着于牧草表面的乳酸菌主要是异型发酵乳酸菌，但数量少[34]，一般达不到优质青贮饲料所需乳酸菌的要求(105cfu·g-1FM)，因此很多学者研究乳酸菌添加剂以提高青贮品质及提高青贮有氧稳定性。然而，接种外源乳酸菌会对牧草附着微生物产生一定影响，且不同牧草中接种不同种乳酸菌对青贮过程中微生物群落结构有不同的影响。Parvin和Nishino的研究表明[35]，添加植物乳杆菌抑制了羊草(Leymuschinensis)本身附着的细菌如一些肠道菌(Enterobacteria)，添加布氏乳杆菌(lactobacillusbuchneri)也会抑制附着于羊草表面的细菌，而在青贮30 d和90 d后细菌多样性有所增加；而对意大利黑麦草、羊草、全株玉米及无芒虎尾草(Chlorisgayana)的研究表明[36]，青贮前的意大利黑麦草表面附着有肠道菌、假单胞菌(Pseudomonaspp)、伯克氏菌(Burkholderiaspp.)、沙雷氏菌(Serratiaspp.)、植物乳杆菌及糊精片球菌(Pediococcusdextrinicus)，接种了植物乳杆菌后对附着菌有一定的抑制作用但只是使DGGE条带模糊，接种了短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)后DGGE结果表明新出现了短乳杆菌而其他杂菌条带变模糊；青贮前全株玉米附着有植物乳杆菌、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)等，接种了植物乳杆菌及短乳杆菌后，基本未改变原有细菌的种类。李雁冰[37]研究了鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)和布氏乳杆菌对黑麦草和玉米青贮微生物群落的影响，结果显示添加鼠李糖乳杆菌对黑麦草青贮过程的细菌和真菌群落影响大于添加布氏乳杆菌组，而添加这两种乳酸菌对玉米青贮过程的细菌和真菌的影响都不大。也就是说，接种外源乳酸菌后会抑制牧草本身附着的微生物，尤其是不利于青贮发酵的真菌及好氧细菌，但抑制效果因牧草本身附着菌的特性及青贮条件有关。而且在青贮发酵开始后接种的乳酸菌会与牧草附着的有害菌进行营养竞争并产生乳酸，乙酸及细菌素等代谢物质抑制有害菌的活动与繁殖，促使青贮过程快速有效进行，减少营养物质损失[38-39]。

2 青贮微生物对青贮饲料品质的影响

微生物在青贮过程中的活动及代谢产物会影响青贮发酵品质。无论是牧草本身附着的微生物还是外源接种的微生物都是影响青贮饲料品质的关键因素之一。

2.1 青贮微生物对青贮饲料发酵品质的影响

在青贮发酵初期，牧草附着的好氧细菌、酵母及霉菌等利用体系残留的氧气消耗牧草营养物质进行繁殖，降低饲料的青贮品质。而随着乳酸菌大量繁殖，代谢产生的乳酸能够快速降低饲料pH从而抑制杂菌，有利于改善青贮品质。然而，一般牧草附着的乳酸菌达不到促进发酵进程的要求，所以学者们想通过接种乳酸菌促进青贮发酵。有很多学者的研究表明添加乳酸菌能通过迅速降低pH、减少干物质损失、抑制杂菌、抑制蛋白降解、提高青贮饲料有氧稳定性等提高青贮品质[40-42]。但也有研究报道，接种乳酸菌对青贮品质没有显著影响甚至会降低青贮品质[43-45]，因为更能适应环境的附着微生物可能更具竞争力而主导青贮过程[46]。Parvin等[36]指出接种乳酸菌对发酵产物的响应不同，所以接种乳酸菌的效果不但要看青贮产物还应看其对附着微生物群落影响进行评价。韩吉雨[27]在苜蓿和玉米青贮研究中得出的结论是原料表面附着的细菌贯穿整个发酵过程，影响着青贮品质，这些菌群也存在演替的过程，说明牧草本身附着的微生物对青贮品质影响很大。然而对青贮微生物群落及演替机理的研究还不清楚，需要了解更多信息来揭示这个复杂的发酵过程。

2.2 青贮微生物对青贮饲料有氧稳定性的影响

当青贮饲料拆封接触空气后，那些在青贮过程中被抑制而未死亡的好氧细菌、酵母及霉菌就会开始活跃进行生长繁殖，饲料的pH值和温度开始升高，同时腐败菌会利用乳酸及饲料营养物质，使得青贮饲料品质下降，进而影响家畜采食量及生产性能。因此，青贮饲料有氧稳定性也是青贮品质评价的重要指标之一，目前研究认为异型乳酸菌可产生一些挥发性脂肪酸，有利于提高青贮有氧稳定性，尽管会消耗更多的营养物质[47]。这些有利于提高饲料有氧稳定性的有机物主要是布氏乳杆菌的代谢产物，包括乙酸和1，2-丙二醇[48-49]。但也有研究表明，乳酸菌提高青贮饲料有氧稳定性的主要原因是其代谢产生的其他物质(表2)。由此可见，青贮饲料发酵过程中乳酸菌代谢产生的能够提高青贮饲料有氧稳定性的物质多样且与乳酸菌的种类有关。Krystynad等[17]研究显示接种植物乳杆菌后有氧稳定性是对照的两倍，接种布氏乳杆菌的有氧稳定性更高。但很多牧草附着微生物中异型乳酸菌在数量上也不足发挥主导作用，更多需要接种外源异型乳酸菌。郭旭生报道[50]指出异型发酵乳酸菌的添加量大于1.0×106cfu·g-1FM时，才能有效提高青贮饲料的有氧稳定性。然而马迪等[51]的研究显示，全株青贮玉米在青贮的14和56天时对照组和添加鼠李糖乳杆菌组的有氧稳定性无差异，青贮90天的玉米中添加鼠李糖乳杆菌和布氏乳杆菌组未能显著提高有氧稳定性；Kleinschmit[52]研究了添加布氏乳杆菌和戊糖片球菌对玉米青贮有氧稳定性的影响，结果表明添加这两种乳酸菌并不能显著提高青贮有氧稳定性。所以牧草本身附着的微生物在青贮有氧稳定性方面有不可忽视的作用，不能为了提高品质及有氧稳定性盲目添加乳酸菌剂，还需要了解原料本身微生物附着情况及特点进行有针对性地接种菌剂。

表2 提高有氧稳定性的微生物种类及其代谢产物Table 2 Microorganism species and their metabolites for improving the aerobic stability of silage

3 小结

牧草附着微生物受很多因素影响，不同牧草种类以及同种牧草生长在不同生长环境，其表面附着的微生物种类和数量都存在很大差异，且在青贮过程中处于不断演替变化中，不同程度影响着青贮品质。为更有效地提高青贮品质及有氧稳定性，学者更多的研究了接种外源乳酸菌对青贮的影响，接种菌在青贮体系中与本身附着的微生物互相竞争，共同完成青贮发酵过程，但牧草本身附着微生物的作用也不可忽视。了解牧草表面附着微生物特性是决定是否需要接种乳酸菌添加剂的重要依据。未来需要研究更多关于青贮微生物组学、代谢组学及青贮过程微生物活性等信息以掌握复杂的青贮过程，为调控优质的青贮饲料提供科学依据。