季新，李飞，晏云，孙红正，张静，李俊周，彭廷，杜彦修，赵全志



基于CRISPR/Cas9系统的水稻光敏色素互作因子基因编辑

季新，李飞，晏云，孙红正，张静，李俊周，彭廷，杜彦修，赵全志

（河南农业大学农学院/河南粮食作物协同创新中心/河南省水稻生物学重点实验室，郑州 450002）

【目的】光作为一种环境信号，可影响植物的基因表达、酶活性和形态建成。光敏色素互作因子在光信号传导过程中起着重要作用。本研究旨在构建水稻光敏色素互作因子的CRISPR/Cas9表达载体，创制突变体，挖掘水稻功能基因，丰富和完善水稻光信号调控分子机制。【方法】依据CRISPR/Cas9技术原理，设计突变靶点。将所设计靶序列在水稻基因组中进行比对，排除非特异性靶位点，同时使该靶序列含有常用酶切位点，方便后期突变体鉴定。化学合成靶位点寡核苷酸序列并与载体pBUN411连接构建CRISPR/Cas9表达载体，利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴，以除草剂抗性标记筛选获得阳性转基因植株。利用酶切法判断T0代转基因植株是否发生突变，结合测序结果分析突变单株的突变基因型。将靶点序列在水稻全基因组中进行比对分析，选择5个与靶序列同源性较高且错配在4 bp以内的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估，分析所设计靶序列特异性。【结果】所构建表达载体成功实现了对的定向编辑，酶切显示在选取的25株T0代转基因植株中获得15株突变体，其中包括5株纯合突变体、6株双等位突变体和4株杂合突变体，共10种不同突变基因型和11个突变株系。……