谭静，宋欣密，傅晓斌，唐明珠，吴帆，华启云，李红亮



中华蜜蜂化学感受蛋白CSP1的功能模式分析及亚细胞定位

谭静1，宋欣密1，傅晓斌1，唐明珠1，吴帆1，华启云2，李红亮1

（1中国计量大学生命科学学院/生物计量及检验检疫技术浙江省重点实验室，杭州 310018；2金华市农业科学院，浙江金华 321000）

【目的】研究中华蜜蜂（，简称中蜂）重组化学感受蛋白CSP1与不同化学信息素的结合功能、模式及其亚细胞定位，明确触角特异表达的CSP1蛋白功能。【方法】将克隆的中蜂构建至pET-32a(+)载体并转入BL21(DE3)感受态细菌中，挑取单克隆菌落接种于LB培养基，培养过夜后按1%（V/V）进行转接，继续培养至OD600≈0.4左右时，加入IPTG至终浓度为1 mmol·L-1后继续诱导5 h。将诱导好的CSP1大肠杆菌菌液离心弃上清，再加入细菌裂解液超声破碎，离心后上清用镍柱对CSP1重组蛋白进行亲和层析纯化，再经PBS透析液透析后，最终获得可溶的具有生物活性的CSP1重组蛋白。设定荧光分光光度计的激发波长为281 nm，测定竞争性荧光探针1-NPN与CSP1的相互作用，用Scatchard方程计算其解离常数，再计算获得CSP1与各种候选化学信息素的亲和力。以CSPMbraA6晶体结构（PDB代码：1n8v）为模板，通过同源建模和分子对接解析CSP1蛋白与化学信息素的结合模式，根据MolDock Score选出最佳对接模型进行作用机理分析，获得结合时配基周围的CSP1残基分布以及氢键产生情况，以此获得信息素与CSP1的结合模式。最后将CSP1免疫注射兔子获得多克隆抗体，并对中蜂工蜂触角进行低温固定、脱水和包埋后进行超薄切片，然后对样品切片进行免疫胶体金电镜定位，以解析CSP1在触角感器中的亚细胞分布。……