魏文平，叶邦策*

（1华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海，200237；2石河子大学化学和化学工程学院，新疆 石河子，832003）

基于荧光蛋白FRET特性DasR与效应小分子的相互作用

魏文平，叶邦策1,2*

（1华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海，200237；2石河子大学化学和化学工程学院，新疆 石河子，832003）

本研究利用黄色荧光蛋白（YFP）和青色荧光蛋白（CFP）构建含有DasR蛋白的双荧光蛋白融合蛋白，以效应小分子与DasR作用前后导致的双荧光蛋白FRET效应变化为指标考察DasR与效应小分子的相互作用。研究结果表明：效应小分子与DasR的相互作用可以通过荧光蛋白FRET特性有效的呈现；该荧光蛋白系统能够反映出单独的DasR小分子结合结构域与效应物质的相互作用。本研究方法为研究调控蛋白与效应小分子相互作用、调控蛋白效应分子的高通量筛选等方面提供了理论借鉴与方法学参考。

荧光蛋白；FRET；DasR；相互作用

微生物转录调控在胞内基因表达及微生物响应环境因素变化方面发挥着重要的作用。以经典的乳糖操作子为例，其控制的靶标基因表达由环境中效应物相对浓度决定：当环境中不存在乳糖或者β-半乳糖苷时，阻遏蛋白结合在操纵子区，阻止RNA聚合酶在启动子区结合；当环境中存在乳糖或者β-半乳糖苷时，产生的异构乳糖与阻遏蛋白的结合，使得原本被阻遏蛋白占据的启动子区释放出来，从而使得RNA聚合酶行使功能，乳糖利用相关酶系表达[1-2]。这种转录水平的操纵子模型在微生物中广泛存在。其中在放线菌中广泛存在一类几丁质、N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）利用调控相关的操纵子，其调控蛋白在不同菌中名称为DasR（Streptomyces coelicolor）[3]；NagR（B.subtilis）[4]；YvoA（Bacillus subtilis）。以YvoA为例，几丁质、GlcNAc代谢产生的6-磷酸葡萄糖胺（GlcN6P）会结合到YvoA的GlcN6P结合结构域，通过改变蛋白构象进而影响到YvoA控制基因的转录水平[4]。

GlcN6P在GlcNAc代谢或者相关活性物质合成过程中具有重要作用：无论是GlcNAc转化成Fru6P进而进入TCA循环，还是糖代谢中间产物通过UDP-GlcNAc-1-P等产物合成肽聚糖，都会生成GlcN6P这一中间产物。DasR通过感知GlcN6P浓度的变化进而对相关基因的表达产生有效的调控作用。这种小分子物质与调控蛋白的相互作用是关键小分子通过变构调节等方式影响调控蛋白的行为，从而使细胞感知外界环境变化的基础。

随着Streptomyces coelicolorDasR蛋白晶体结构的解析[6]，探索建立高效的DasR与效应小分子GlcN6P的相互作用的研究方法，将有利于为放线菌中其他调控蛋白和效应小分子的相互作用提供方法论的借鉴。供体荧光蛋白和受体荧光蛋白之间的荧光能量共振转移（Fluorescence Resonance Energy Tansfer，FRET） 效 应在研究蛋白-蛋白相互作用[7]、小分子动态检测[8]等方面得到广泛的应用。本研究在本课题组前期利用荧光蛋白FRET特性构建生物传感器[9-10]的技术平台基础上，通过构建含有DasR的双荧光蛋白的融合蛋白体系，并通过FRET特性考察DasR与效应小分子GlcN6P的相互作用。

1 材料与方法

1.1 材料

双荧光蛋白表达质粒PET28a-YC由本实验室保藏；菌种 DH5α 和 BL21（DE3）、Streptomyces coelicolor等均由本实验室保藏。

1.2 材料试剂和仪器

引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；实验中所用限制性内切酶均购买于宝生物工程有限公司（Takara,大连，中国）；蛋白纯化Ni柱购买于常州天地人和生物科技有限公司；荧光测定采用BioTek酶标仪测定（佛蒙特州，美国）；pH 7.4 PBS缓冲液购自上海百赛生物科技有限公司。菌种培养LB培养基购自上海捷瑞生物科技有限公司；GlcN6P和 GlcNAc6P 购 自 Sigma 公 司 ；Glc6PNa2、GlcN、Fru6PNa2购自索莱宝公司。

1.3 含有DasR的双荧光蛋白体系建立

利用表1中引物（采用软件Primer 5.0设计），取Streptomyces coelicolor基因组作为模板，按照高保真酶说明书（南京诺唯赞生物科技有限公司）指导进行PCR扩增，得到5'端含有EcoRI酶切位点及3'含有SacI酶切位点的DasR(SCO5231)片段；DasR纯化后利用EcoRI和SacI酶切，然后将纯化回收后的DasR片段与经过同样的双酶切并经纯化的PET28a-YC在 16 ℃条件下连接 1.0 h（Takara,DNA Ligation Kit Ver.2.1）。连接产物转化DH5α，挑取阳性克隆，使用T7引物测序正确的质粒转化至BL21(DE3)备用。

1.4 蛋白纯化

蛋白诱导表达及其纯化方法来自参考文献[9-10]。其中IPTG浓度选择0.4 mmol/L。

1.5 蛋白与小分子相互作用测定方法

小分子溶解在pH 7.4 PBS溶液中，调整pH到7.4；蛋白经过如方法1.4的纯化步骤后，保存在pH 7.4 PBS溶液中；添加90 μL的蛋白溶液至不透明的黑色96孔板，添加小分子效应物浓度至5 mmol/L，使用pH 7.4 PBS补加至终体积为100 μL。通过酶标仪测试激发光为430 nm，发射光在450-600 nm波长处的荧光值，每隔2 nm读取一个数值。

1.6 数据处理

酶标仪测定的荧光数据导出后，计算在476 nm和 528 nm处的荧光值的比值R（F476/F528）；通过origin 9.0软件绘制荧光值变化曲线图。通过比较小分子添加前后R的变化考察小分子与DasR的相互作用。

2 实验结果与分析

2.1 荧光蛋白FRET特性能反映小分子与DasR的相互作用

（1）存在于双荧光蛋白之间的FRET特性受制于供体荧光蛋白和受体荧光蛋白之间相对距离的变化。假如两荧光蛋白之间的距离在10 nm范围内发生足够的变化，FRET特性会以比值R（F476/F528）变化的形式直观的表现出来。图1显示：

（1）与单一YC-DasR相比，GlcN6P使得YC-DasR在476 nm处的荧光值增加，在528 nm处的荧光值减小。由于此荧光值是在CFP的激发光范围内得到的，所以YFP在528 nm处的荧光是通过称为FRET效应的以非辐射能量传递的方式获得的。因此，图1A结果说明GlcN6P加入造成的R值改变（是由于GlcN6P与YC-DasR中DasR相互作用改变了CFP与YFP相对空间距离）可以有效地研究GlcN6P与DasR的相互作用。

（2）在以往的研究中，通过EMSA实验已经证明DasR蛋白同源蛋白家族功能的发挥受制于GlcN6P浓度[5]。通过GlcN6P加入前后R改变及其原因分析，采用图1B所示的示意图可以形象的表示随GlcN6P浓度变化引起的FRET效应强弱变化，以此反映小分子与蛋白的相互作用。

（3）通过数据库中（http://www.kegg.jp/ssdbbin/ssdb_motif kid=sco:SCO5231）数据分析可知：DasR蛋白N端结构包含Crp-like helix-turn-helix domain等DNA结合相关转录调控结构域；主要的小分子结合结构域集中在C端（如图1C）。

（4）仅含小分子结合结构域的YcDasR88-252双荧光蛋白体系也能响应GlcN6P的加入（图1D），即荧光蛋白FRET特性直观显示DasR与小分子的相互作用是基于C端小分子结合结构域发生的。

（5）构建的含有DasR的双荧光蛋白体系可以反映DasR与GlcN6P的相互作用。

图1 荧光蛋白FRET特性响应DasR和小分子GlcN6P的相互作用Fig.1 FRET of YFP-CFP pair response to the interaction between DasR and small molecule GlcN6P

2.2 荧光蛋白FRET特性检测DasR同源蛋白与效应小分子相互作用

红霉菌与天蓝色链霉菌同属放线菌，二者在形态发育、次级代谢、转绿调控等方面具有许多相似的特征。红霉菌中DasR的同源蛋白在KEGG中的编号为SACE_0500[11]。此蛋白在红霉菌中发挥的调控作用已在本课题组成员的前期研究中涉及[11]，但研究中尚未涉及FRET特性能否检测DasR同源蛋白与效应小分子相互作用。

图2显示：

（1）红霉菌中DasR同源蛋白与GlcN6P相互作用，依然可以通过测定GlcN6P的加入前后YFP和CFP特征峰处的荧光强度变化来衡量。

（2）荧光蛋白FRET特性检测DasR同源蛋白与效应小分子相互作用具有可推广性。

图2 荧光蛋白FRET特性响应糖多孢红霉菌DasR同源蛋白和GlcN6P的相互作用Fig.2 FRET of YFP-CFP pair response to the interaction between DasR Homologous protein fromSaccharopolyspora erythraeaand GlcN6P

2.3 荧光蛋白FRET特性对DasR的效应小分子具有选择性

GlcN6P作为重要的中间代谢产物，在微生物体内既可以通过几丁质、GlcNAc代谢产生；又可以通过果糖6磷酸（Fru6P）转化而来。GlcN6P在结构上与Glc6P、GlcN、Fru6P、GlcNAc6P 等具有很高的相似性。在体内环境中，以上物质往往与Glc6P共存，所以DasR与主要的效应小分子GlcN6P相互作用可能不同程度受到以上物质的影响，为此考察YC-DasR体系对于 GlcN6P、Glc6P、GlcN、Fru6P、GlcNAc6P 响应差异，有助于更好理解DasR与效应小分子相互作用。

图3显示：

（1）YC-DasR体系对于GlcN6P的响应最显著，对于GlcNAc6P的响应次之（图3A）。这种结果说明，DasR在诸多的GlcN6P结构类似物中能够有效的识别GlcN6P和GlcNAc6P的存在。DasR同源蛋白YvoA与GlcN6P结构类似物的相互作用试验中也存在以上规律[4]。区别在于研究者在研究GlcN6P结构类似物对YvoA的DNA结合能力的影响（即与GlcN6P结构类似物的相互作用）时采用的技术手段为EMSA[4]。本研究结果从GlcN6P结构类似物影响DasR及同源蛋白结构变化的视角更加直观的解释了特定小分子通过特异性的结合，改变蛋白结构；这种改变应该是导致DasR及同源蛋白响应特定小分子而对转录水平产生差异性调节的基础。

（2）图3B所示实验仅以含有DasR效应物结合结构域的荧光蛋白体系研究相互作用。这种利用荧光蛋白FRET特性研究调控蛋白结合结构域与效应物相互作用的实验方法，是传统的EMSA实验所不能实现的：EMSA实验不仅需要整个调控蛋白，而且需要操纵子区的DNA，以调控蛋白与DNA结合能力受到小分子干扰的程度来衡量小分子与蛋白的相互作用。

图3 荧光蛋白FRET特性对不同效应小分子的响应Fig.3 FRET of YFP-CFP pair response to the different small molecule

2.4 FRET特性、DasR与小分子相互作用应用前景的分析

GlcN6P除了在微生物中作为重要的中间代谢产物及调控效应物质外，在高等生物中也具有以下重要的作用：

（1）有研究考察 glucosamine(GlcN)对于胰岛素抗性的影响时，添加GlcN会导致葡萄糖的吸收减少，同时伴随着GlcN6P浓度的升高。由GlcN转化而来的GlcN6P会变构抑制（allosteric inhibition）己糖激酶导致糖转运系统受阻[12]。

（2）在哺乳动物细胞中，谷氨酰胺：6-磷酸果糖酰胺转移酶（Glutamine-fructose-6-phosphate aminotransferase，GFAT）作为己糖胺途径的限速酶（其作用产物就是GlcN6P），直接影响己糖胺途径的活力[13-14]。鉴于GlcN6P的重要作用，如果能在体内实时高效的检测GlcN6P，将有助于GFAT酶活性等方面的研究，而且研究DasR与GlcN6P的相互作用可能为建立基于FRET效应的GlcN6P检测生物传感器积累经验。

3 结论

（1）本实验基于荧光蛋白 FRET特性研究了DasR与效应小分子的相互作用，发现荧光蛋白FRET特性可以较好地甄别调控蛋白DasR的特定效应物，有望在其他调控蛋白与小分子相互作用研究方面得到应用。

（2）本实验构建的相互作用考察体系，只需要酶标仪读取荧光便可以筛选特定的效应物，有望实现蛋白和效应小分子匹配的高通量筛选。

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Studying the interaction between DasR and its effector based on the FRET of bimolecular fluorescence protein

Wei Wenping1,Ye Bangce1,2*
(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,East China University of Science&Technology,Shanghai 200237,China;School of Chemistry and Chemical Engineering,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China)

In this study,interaction between DasR and its effector was investigated by using FRET effect change of the fusion protein,which included YFP,CFP and DasR.Results have shown that FRET features of fluorescent protein can effectively response to the interaction of small molecules and DasR.At the same time,the fluorescent protein system can reflect the interaction of effector and individual small molecules combining structural domain of DasR.This research provides the theory and methodological reference for the studying of interaction between regulation protein and smaller molecular,and effector high-throughput screening of regulation protein

fluorescence protein;FRET;DasR;interaction

Q3

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.04.001

1007-7383(2017)04-0397-05

2017-01-09

国家自然科学基金项目（21335003，21675052，21575089）

魏文平(1988-)，男，博士研究生，专业方向为生物化工。

*通信作者：叶邦策(1967-)，教授，长江学者，e-mail：bcye@ecust.edu.cn 。