范红英，陈 圆，曾凤群，李红伟

（惠州学院 生命科学学院，广东 惠州 516007）

不同日龄惠阳胡须鸡肌肉中IGF1、MyoD基因表达研究

范红英，陈 圆，曾凤群，李红伟

（惠州学院 生命科学学院，广东 惠州 516007）

已有研究表明，IGF1（胰岛素样生长因子1）、MYOD（肌分化因子）基因在肌细胞的生长、增殖、分化上具有重要的调控作用.本研究以在惠阳胡须鸡为研究对象，采集不同日龄（86、155、213、300、394、454）的惠阳胡须鸡的胸肌和腿肌，然后通过提取RNA、反转录、聚合酶链式反应（PCR）、荧光定量PCR分析了这两个基因在不同日龄惠阳胡须鸡的胸肌和腿肌中的表达情况.半定量结果发现，MYOD基因只在86日龄的腿肌中表达，而IGF1基因在不同日龄的胡须鸡胸腿肌中均有表达，而荧光定量PCR的结果显示IGF1基因在胸腿肌的相对表达量存在差异，但没有达到显著性.这些结果为深入了解IGF1基因在鸡肌纤维生长发育过程的作用提供了新的证据.

惠阳胡须鸡；IGF1基因；MyoD基因；荧光定量PCR1

IGF1，全称为胰岛素生长因子1（insulin-like growth factor1，IGF1），其基因定位于鸡的1号染色体.MyoD即肌分化因子，是生肌调节因子家族的四成员之一，其基因定位在鸡的5号染色体.研究认为，鸡出生后生长发育与鸡的IGF1基因的调节潜力相关，其可以调节自身的半衰期和活性，而且在细胞周期、代谢、生长、增殖和分化等过程中起重要的调控作用［1-2］.在对生肌调节因子家族的相关研究中表明，MyoD基因在肌肉生长、发育、再生和退化等过程具有重要作用.肌原细胞的分化能力与MyoD基因的表达水平相关［3-6］.但这两个基因在鸡肌纤维后期生长发育过程的表达情况未见报道.

本研究以IGF1、MyoD基因作为鸡的肌肉生长发育相关的候选基因进行研究，检测后期6个不同日龄惠阳胡须鸡胸腿肌中IGF1、MyoD基因的表达水平，分析IGF1、MyoD基因的表达与鸡不同发育阶段的关系，为深入了解鸡肌纤维生长发育相关基因的表达规律提供新的证据［7-9］.

1 材料与方法

1.1 试验鸡群

实验鸡群来自广东金种农牧科技股份有限公司，选取6个不同日龄（86天，155天，213天，300天，393天，454天）的惠阳胡须鸡鸡胸、腿肉为试验材料，取样后迅速放入液氮保存.

1.2 引物设计

DNA引物采用的是李娟［10］鸡生长发育和肌纤维生长相关基因表达研究所设计的引物，MyoD目的基因片段大小为113bp，IFG1目的基因的片段大小为111bp.引物序列如表1.引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成.

表1 引物序列

1.3 PCR反应

PCR反应体系的总体积是25µL，其中的组分如下：

根据引物来源文献进行多次PCR预实验，最终确定PCR最佳反应条件为：预变性，5分钟；变性，94℃，30秒；退火，60℃，30秒；延伸，72℃，30秒；循环数40，最后72℃延伸5分钟.

1.4 荧光定量PCR

荧光定量采用7000 System SDS Software，程序设定如图1所示.

利用Trizol抽提法提取的RNA，反转录，通过荧光定量PCR进行基因表达分析.荧光定量采用7000 System SDS Software，设定收集退火温度时荧光信号的实时变化，记录PCR扩增产物反应中的每一个循环扩增产物量的变化.反应程序每个样品设置3个重复，将2ul的cDNA溶液换成2ul denuclease-free H2O设定空白管为阴性对照.

图1 荧光定量PCR流程图

1.5 统计分析

采用相对定量分析法2-ΔΔct分析，根据数据结合以下的公式计算出各待测基因与对照组的基因表达水平倍比F［11］.2-（ΔΔct）表示的是待测组目的基因的表达相对于对照组数的变化倍数.

2 结果与分析

2.1 提取RNA的结果

提取RNA用琼脂糖凝胶电泳法检测，凝胶成像结果如下（见图2）.从图中看出，凝胶孔内基本可见RNA条带，无拖带，颜色明亮清晰，说明RNA提取的效果较理想，可用于实验下一步的反转录和PCR扩增.

图2 RNA提取结果

2.2 聚合酶链式反应（PCR）结果

反转录后，PCR扩增结果经琼脂糖凝胶电泳检测，内参基因b-actin的PCR扩增效果如图3所示.如图4所示，目的基因MyoD片段长度是113，与Marker比对是吻合的.目的基因IGF1（13～24）片段长度是111bp，与Marker比对也是吻合的，条带较清晰，表明扩增片段与目的基因片段大小一致.1、2，3、4，5、6，7、8，9、10，11、12分别是86日龄胸腿肌、155日龄胸腿肌，213日龄胸腿肌，300日龄胸腿肌，393日龄胸腿肌，454日龄胸腿肌的MyoD基因PCR扩增结果.13、14，15、16，17、18，19、20，21、22，23、24分别是86日龄胸腿肌、155日龄胸腿肌，213日龄胸腿肌，300日龄胸腿肌，393日龄胸腿肌，454日龄胸腿肌的IGF1基因PCR扩增结果.

图3 内参基因b-actin扩增结果

图4 MyoD、IGF1基因聚合酶链式反应扩增结果

从图4看出，标号为1～12目的基因MyoD的PCR结果显示，MyoD基因只在胡须鸡86日龄的腿肌和213日龄的腿肌低水平表达，在其他的日龄的胸腿肌中没有表达.

同样，标号为13～24目的基因IGF1的PCR结果表明，IGF1基因在惠阳胡须鸡的6个不同日龄中均有表达.因此，我们对该基因的表达通过荧光定量PCR进一步分析研究.

2.3 荧光定量PCR结果

如图5所示，IGF1基因在惠阳胡须鸡86-454天不同日龄的胸肌腿肌间表达量均无显著差异（P＞0.05），IGF1基因在86～393日龄胸肌的相对表达量是逐步降低的，IGF1基因在155～300日龄胸肌的相对表达量基本相同，393日龄的最低，但是IGF1基因在454日龄的相对表达量突然升高，其中原因需进一步分析研究.相比IGF1基因在胸肌相对表达量的规律性，在腿肌的相对表达量则没有表现出规律，但IGF1基因在300日龄的胸肌腿肌的相对表达量都比其他日龄低.

图5 IGF1基因的相对表达量

3.讨论

3.1 MyoD基因的表达

MyoD基因在肌肉生成早期分化过程中和成肌细胞增殖阶段进行表达［12］，具有决定肌卫星细胞能否成为肌肉干细胞的功能，在肌肉的发育过程具有重要作用［13－15］.Liu［16］等在研究火鸡胚胎发育时发现，随着火鸡的胚胎发育，MyoD基因表达量呈显著下降趋势.王均［17］等研究也表明，MyoD基因的表达在胚胎发育第9天已基本达到峰值，表达水平在第9-1 3天期间相对稳定，1 3天后表达水平下降，但在新生时呈现短暂的反跳增高现象，之后表达又降至难检测水平.这说明M y oD基因主要在鸡早期的发育阶段表达.本研究中，MyoD基因在86日龄腿肌中有低水平表达，在其他日龄鸡肌肉组织中没有表达，进一步证明该基因主要在鸡肌肉生长发育早期阶段表达.

3.2 IGF1基因的表达

宋卫涛［16］等研究结果表明，IGF-1基因对鸭胚胎期腿肌的生长发育具有重要意义.梁耀伟［17］等研究表明，IGF1可能在鸡胚胎肌肉的生长发育过程中起调控的作用，同时它的表达规律与成肌细胞增殖一致，可能参与调控成肌细胞的增殖.李娟等［10］的研究表明，70日龄的二郎山山地鸡SD02品系中胸肌IGF1基因表达量是显著高于49日龄的.这些研究结果表明，IGF-1基因不但在鸡胚胎肌肉发育早期有调控作用，而且参与调控了成肌细胞的生长发育过程.本研究结果表明，IGF1基因在六个日龄的胸肌、腿肌均有表达，这表明该基因可能在鸡肌肉后期生长发育中有着重要作用.

而惠阳胡须鸡腿肌的IGF1基因表达量在86日龄到155日龄是呈增长趋势，从155日龄到300日龄腿肌中IGF1基因的表达量却出现明显的减少，但393日龄和454日龄的胡须鸡腿肌中的IGF1基因的表达都很高，可能是饲养的时期过长，与肌肉的再生与分化有关.因此需要进一步研究发育后期胡须鸡肌肉中IGF1基因的作用机理，全面深入了解IGF1基因对惠阳胡须鸡肌肉生长发育的影响，以便更好地指导育种实践.

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【责任编辑：吴跃新】

Study on the Expression of IGF1 and MyoD Genes in Huiyang Bearded Chicken at Different Age

FAN Hongying，CHEN Yuan，ZENG Fengqun，LI Hongwei
(School of Life Science，Huizhou University，Huizhou 516007，Guangdong，China)

It was reported that IGF1(insulin like growth factor 1)and MYOD(muscle differentiation factor)genes play an important role in the growth，proliferation and differentiation of muscle cells.In the study samples from breast and leg muscle of Huiyang beared chickens at different day age were collected，followed by RNA extraction，reverse transcription.Polymerase chain reaction(PCR)and fluorescence quantitative PCR were used foranalyzing the expression of the two genesin breast and leg muscleof Huiyang beared chickens at different days in age.The results showed that expression of the MyoD gene is detected in breast and leg muscle of Huiyang beared chickens at 86 days old，but IGF1 gene in breast and leg muscle of Huiyang beared chickens at different days in age.These results provide new evidences for the further understanding of the expression of genes related to growth and development of muscle fiber in chickens.

Huiyang Bearded Chicken；IGF1gene；MyoD gene；fluorescence quantitative PCR

S858.31

A

1671-5934（2017）03-0061-04

2017-03-20

惠州市科技专项资金（2014B040008002）；广东省普通高校特色创新项目（自然科学类）（2014KTSCX178）

作者简介：范红英（1962-），女，广东兴宁人，高级实验师，研究方向为动物组织与生理学，Email：fhy@hzu.edu.cn