吴 迪, 李晨迪, 王 婷, 王一鸣, 田 宁

(沈阳师范大学 物理科学与技术学院, 沈阳 110034)

激素超排对小鼠卵母细胞染色体空间形态的影响

吴 迪, 李晨迪, 王 婷, 王一鸣, 田 宁

(沈阳师范大学 物理科学与技术学院, 沈阳 110034)

激素超数排卵作为一种非自然排卵方式,在临床辅助生殖及基础科学研究中应用广泛。但此种排卵方式对卵母细胞成熟质量的影响仍不明确。鉴于此,以荧光标记、双光子成像及图像三维重构为技术基础,量化研究激素超排获取的卵母细胞中染色体的空间构象情况。结果表明,激素超排造成染色体空间排布异常,但不影响染色体的体积、表面积等几何构型。此结果可能提示激素超排干扰了染色体的运动与迁移功能,希望能为深入认识激素超排技术提供有用的参考。

激素超排; 荧光标记; 双光子荧光成像; 染色体构象

0 引 言

激素超排是指在雌性哺乳动物发情的恰当时期,通过注射外源促性腺激素的方法,使卵巢比自然发情时有更多的卵泡发育并排卵的现象[1]。在实际生产中,超数排卵有提高母畜繁殖力、保存濒危动物物种的功效[2-3]。在临床辅助生殖医学领域,以激素超排方法促进女性超数排卵,以便实现卵子冷冻保存及试管婴儿等临床诉求。在基础科学研究中,由于动物自然排卵量少且排卵时间不固定,在制作转基因动物[4]、嵌合体动物[5]、体外受精[6]等生物工程研究中,常需要利用激素超排获取大量的卵母细胞。激素超排属于不正常排卵方式,但是在以成熟卵母细胞为研究对象的应用及科研活动中,常需要利用此技术获得超常数量的研究样品。那么,超数排卵是否影响哺乳动物卵母细胞质量是实际生产、辅助生殖及科学研究的基础。针对此问题,国内外已取得一些研究进展:张兴会等人以绒山羊为模型,对幼畜超排后得到的卵母细胞进行裸卵镜检,通过统计异常卵数量及卵母细胞极体率,得出卵母细胞终会成熟但比正常卵母细胞质量差的结论[7]。M.F.Martinez等人对超数排卵的绵羊卵母细胞进行研究,使用普通光学显微镜观察卵细胞形态,发现超排导致卵母细胞形态畸变率增加[8]。邝素华等人通过核型分析技术对比了激素超排与体外成熟卵母细胞的染色体情况,并认为单倍体率、非整倍体率及染色体畸变率无显著差异[9]。应该指出,一方面,利用普通光学显微镜可二维观测卵胞质的折光性、卵细胞几何尺寸、卵周间隙大小等形态指标,并得到丰富的实验结果。但此成像手段不具备纵向层析能力,且分辨率及辨识度有限,无法观测卵胞质内细胞器或遗传物质的情况。另一方面,核型分析技术需要裂解卵母细胞形态,使染色体二维平铺于载玻片上,可见该技术无法原位地获得染色体的三维构象。且邝素华的研究缺少对比激素超排与自然排卵的卵母细胞之间的差异,无法准确获知激素超排技术对卵母细胞质量的影响。本文以小鼠为动物模型,综合荧光标记、双光子成像以及图像三维重构技术,原位且量化地分析了激素超排对小鼠成熟的卵母细胞染色体空间构象的影响。希望本文的研究结果能为深入认识激素超排技术提供有用的数据。

1 实验方法

1.1 样品制备

1) 激素超排组:7～8周龄ICR雌性小鼠,腹腔注射孕马血清促性腺激素5 IU/只,48 h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素5 IU/只。15 h后脱颈椎致死。随后无菌摘取输卵管,并于输卵管膨大处采集体内成熟卵母细胞。

2) 自然排卵组:本实验在上午8～10点期间采集正常小鼠输卵管,从40只小鼠样本中采集到5个膨大的输卵管,并成功采集到约100个自然排卵的成熟卵母细胞。

1.2 荧光成像

1) 荧光标记:将成熟卵母细胞置于4%的多聚甲醛中固定30 h,经0.3% 磷酸盐缓冲液清洗3遍。再经5 μg/ml Hoechst 33342荧光染色20 h。清洗3遍后用于观测。

2) 成像系统:本文使用双光子荧光显微成像系统采集染色体的三维图像。该系统由Bio-rad MRC 1024扫描成像单元与Nikon TE 300倒置显微镜组合而成。实验中物镜使用100×oil 镜(平场复消色差物镜, NA=1.4, Nikon);激光波长设为780 nm,焦平面处激光的平均功率约30 mW;纵向步长设置为0.5 μm。

1.3 数据分析

1) 染色体体积V=(标记染色体的荧光团拥有的像素个数)×(三维像素尺寸)。其中,三维像素的尺寸为0.072×0.072×0.5 μm3。

2) 染色体表面积S=(标记染色体的荧光团最外层拥有的像素个数)×(三维像素尺寸)。

3) 染色体异常排布比率=(异常排布的染色体数目÷染色体总数)×100%。

4) 本文使用SPSS 16.0检验两组数据间差异。自然排卵组与激素超排组间染色体体积、表面积的区别通过单因素方差分析做比较。染色体异常排布比率的区别通过卡方检验实现。p<0.05表示结果有显著性差异。

2 实验结果

本文共观察到3种染色体形态(图1):1) 正常排布的染色体分布均匀,排列整齐;2) 错位排布的染色体中有个别染色体脱离其他染色体,游离于赤道面外;3) 不整齐排布的染色体在赤道面上下参差排列。其中染色体错位排布及不整齐排布为异常排布方式。

自然排卵组染色体异常排布的比率约5.4%,明显小于激素超排组的情况(12.8%,p<0.05,见图2a)。进一步发现,自然排卵组染色体体积为259.5 μm3,表面积为362.2 μm2,激素超排组相应数据分别为261.1 μm3,367.6 μm2,这2组数据间无显著差异(图2b)。

图1 染色体正常排布、错位排布及不整齐排布

图2 染色体异常排布比率(a)及几何构型比较(b)

3 讨 论

染色体作为遗传物质的重要载体,常利用分子生物学手段(如PCR技术[10])进行研究。但分子生物学手段通常建立在裂解细胞,破坏染色体结构的基础上,因此利用该方法无法获知染色体在细胞内的空间定位及三维构型信息,应指出染色体的空间构象(即空间定位或排布及几何构型)可反映染色体的多种功能。本文基于双光子成像技术和图像重构技术,三维立体地研究染色体空间定位情况。研究发现激素超排组中染色体异常空间排布的比率明显高于自然排卵组(p<0.05)。这表明激素超排可能影响染色体的空间定位,即干扰染色体的正常运动与迁移。吴银铃在研究超排激素对囊胚的影响时,也发现了激素超排造成的染色体排列紊乱的现象[11]。

本文进一步对比了自然排卵组和激素超排组卵母细胞中染色体的体积和表面积。结果表明,激素超排组染色体的体积和表面积与自然排卵组无显著差异(p>0.05)。染色体体积可表征染色体在卵胞质内的空间占位情况,也可表征染色体蜷缩的紧密程度,而表面积可表征染色体与卵胞质的空间接触。激素超排组和自然排卵组染色体体积及表面积无明显差异,可能说明激素超排未影响到染色体的空间构型。

本文结果可能提示激素超排不干扰染色体的空间构型,但影响染色体的空间定位。染色体空间定位与纺锤体功能及调控染色体排列、运动的基因紧密相关[12-14]。染色体空间构型与染色体的表观修饰(如甲基化、乙酰化等)及促细胞成熟、促分裂相关的蛋白激酶紧密相关[15-16]。激素超排引起的染色体空间构象的改变可能提示超排激素可干扰纺锤体功能,影响染色体运动的调控基因,但不影响染色体凝缩及表观修饰等基因和蛋白的表达与活性。然而具体的分子机制有待于进一步实验探究。此外,染色体空间排布异常比率增高可能与卵母细胞未完全成熟有关。自然排卵周期长,排出的卵母细胞已完全成熟,其染色体空间排布异常比率较低。而超数排卵是激素诱导的卵母细胞提前排出,致使卵母细胞可能未完全成熟,从而导致染色体错位排布及不整齐排布的情况增多。

本文基于双光子荧光显微成像技术及三维重构技术,原位地重建了小鼠卵母细胞染色体的三维形态。经量化分析发现激素超排影响成熟的卵母细胞染色体空间构象,超排激素干扰染色体空间排布,但不影响染色体的空间构型。希望本文研究结果能为深刻认识激素超排技术提供有用的参考数据。

致 谢 感谢清华大学马万云课题组对本文数据采集工作的支持与帮助。

[ 1 ]路佩瑶,张春香,岳文斌. 超数排卵在哺乳动物中的应用[J]. 山西农业科学, 2009,37(5):84-87.

[ 2 ]INYAWILERT W,LIAO Y J,TANG P C. Superovulation at a specific stage of the estrous cycle determines the reproductive performance in mice[J]. Reproductive Biology, 2016,16(4):279-286.

[ 3 ]CHENOWETH P J. Influence of the male on embryo quality[J]. Theriogenology, 2007,68:308-315.

[ 4 ]MYELNIKOV D. Transforming mice:technique and communication in the making of transgenic animals[D]. Cambridge:University of Cambridge, 2015.

[ 5 ]FORBES B. Computational and Visualization Techniques for Structural Bioinformatics Using Chimera[M]. Boca Raton:CRC Press, 2014:24-26.

[ 6 ]YANG Rui,LI Hongzhen,LI Rong,et al. A comparison among different methods of letrozole combined with gonadotropin in an antagonist protocol and high-dose gonadotropin ovarian stimulation antagonist protocol in poor ovarian responders undergoing in vitro fertilization[J]. Archives of Gynecology and Obstetrics, 2016,294(5):1091-1908.

[ 7 ]张兴会,张世伟,宋先忱,等. 幼龄母羊超数排卵及卵母细胞成熟效果分析[J]. 中国畜牧兽医, 2011,389(11):136-139.

[ 8 ]MARTINEZMF,MCLEOD B,TATTERSFIELDG,et al. Successful induction of oestrus, ovulation and pregnancy in adult ewes and ewe lambs out of the breeding season using a GnRH+ progesterone oestrussynchronisation protocol[J]. Animal Reproduction Science, 2015,155:28-35.

[ 9 ]邝素华,龚春柳,吴锐辉,等.小鼠体外成熟与激素超排卵母细胞核型分析[J]. 癌变·畸变·突变, 2003,15(3):133-137.

[10]张恒庆,朱立南,杜洋,等. 藜ISSR-PCR反应体系的优化[J]. 沈阳师范大学学报(自然科学版), 2011,29(2):255-257.

[11]吴银铃. 小鼠超数排卵后胚胎质量评价[D]. 保定:河北大学, 2016.

[12]EAGENK P,HARTLT A,KORNBERGRD. Stable Chromosome Condensation Revealed by Chromosome Conformation Capture[J]. Cell, 2016,62(2):141-151.

[13]李奇慧,朱明学,张黎明,等. 硫芥诱导小鼠染色体畸变和微核形成作用的研究[J]. 第三军医大学学报, 2004,26(19):1701-1703.

[14]CHARD L R,NORTON M E. Genetic Counseling for Patients Considering Screening and Diagnosis for Chromosomal Abnormalities[J]. Clinics in Laboratory Medicine, 2016,36(2):227-236.

[15]MARGOT J B,EHRENHOFER-MURRAY A E,LEONHARDT H. Interactions within the mammalian DNA methyltransferase family[J]. BMC Molecular Biology, 2003,4:7-15.

[16]TATON C,CARBONE M C,GALLO R,et al. Age-associated changes in mouse oocytes during postovulatory in vitro culture: possible role for meiotic kinases and survival factor BCL2[J]. Biology of Reproduction, 2009,74(2):395-402.

Effects of hormone induction ovulation on mouseoocyte chromosomes

WUDi,LIChendi,WANGTing,WANGYiming,TIANNing

(College of Physics Science and Technology, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China)

Hormone induction ovulation (HIO), asa non-natural ovulation, is widely used in the clinical assisted reproduction and basis scientific research. However, the negative effects of HIO on the oocyte maturation quality are still uncertain. In view of this, this paper used fluorescence labelling, two-photon imaging and three-dimensional reconstruction to study the HIO-induced changes on the chromosomal architecture in the matured mouse oocytes. Our results showed that HIO caused an increase in the abnormal chromosomal arrangement, but had little effects on the chromosomal volume and surface area. This might suggest that HIO disturbed the function of chromosome movement or migration. It is hoped that this study can offer useful reference for further understanding HIO.

Hormone induction ovulation; fluorescence labelling; two-photon imaging; chromosomal architecture

2017-01-02。

辽宁省科技厅自然科学基金资助项目(2015020715)。

吴 迪(1979-),男,辽宁沈阳人,沈阳师范大学副教授,博士。

1673-5862(2017)03-0277-04

Q631; Q632

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2017.03.003