朱景乐

(国家林业局泡桐研究开发中心，郑州，450003)

苗作云

(黄河科技学院)

张少伟

(河南农业职业学院)

张明远

(中国林业科学研究院寒温带林业研究中心)

马顺兴

(河南投资集团有限公司)

3个观赏型杜仲品种叶片生理特征的比较1)

朱景乐

(国家林业局泡桐研究开发中心，郑州，450003)

苗作云

(黄河科技学院)

张少伟

(河南农业职业学院)

张明远

(中国林业科学研究院寒温带林业研究中心)

马顺兴

(河南投资集团有限公司)

以原阳杜仲良种繁育圃的‘红叶’杜仲(E.ulmoides‘Hongye’)、‘密叶’杜仲(E.ulmoides‘Miye’)、‘小叶’杜仲(E.ulmoides‘Xiaoye’)3个良种的2年生嫁接苗为实验材料，对叶片进行显微观测，并测定了叶片色差值、植物色素质量分数、可溶性糖质量分数、叶片pH值，分析3个杜仲品种叶片的生理生化差异。结果表明：显微镜下观测到‘红叶’杜仲的正面含有大量的红色细胞，其他品种均未观测到红色细胞；‘红叶’杜仲的亮度(L值)为28.17、变红度(a*值)为0.96、变黄度(b*值)为2.69，计算得到颜色指数为5.54，达到深红级别；‘红叶’杜仲品种叶绿素a质量分数(wa)为1.100 9 mg·g-1、叶绿素b质量分数(wb)为0.454 5 mg·g-1、类胡萝卜素质量分数(wcar)为0.445 5 mg·g-1、总叶绿素质量分数(wt)为1.555 4 mg·g-1、花色苷质量分数(wA)为0.304 2 mg·g-1；葡萄糖质量分数为2.94 mg·g-1、果糖质量分数1.20 mg·g-1、蔗糖质量分数为2.12 mg·g-1；pH值为5.90。方差分析表明：‘红叶’杜仲叶片色差值、色素质量分数，与其他品种间均存在显著差异；但pH值、可溶性糖质量分数，3个品种间无差异。叶色差异的主要原因是色素种类及含量的不同。

杜仲；叶片生理特征；叶片颜色

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是我国特有的经济树种，也是分布范围最广的胶源植物[1]。除了具备极佳的药用功能外，杜仲树形优美，病虫害少，也是一种较好的园林绿化树种。‘红叶’杜仲(E.ulmoides‘Hongye’)是杜仲叶色突变体，是由中国林业科学研究院经济林研究开发中心于1996年从实生苗中选出的观赏型杜仲良种之一[2]。其叶色鲜红，花色苷质量分数显著高于普通杜仲[3]。但是，关于‘红叶’杜仲叶片生理生化特征及叶色形成机制的报道较少。本文以原阳杜仲良种繁育圃的‘红叶’杜仲、‘密叶’杜仲(E.ulmoides‘Miye’)和‘小叶’杜仲(E.ulmoides‘Xiaoye’)3个良种的2年生嫁接苗为实验材料，通过对叶片生理生化指标测定，分析影响杜仲叶片不同颜色的直接原因，旨在为后期新品种选育及配套高效栽培技术提供参考。

1 材料与方法

3个良种的2年生嫁接苗‘红叶’杜仲、‘密叶’杜仲、‘小叶’杜仲，取自原阳杜仲良种繁育圃。每个品种各选择生长一致的单株3株，取其典型叶片进行相关形态指标及生理指标测定。

叶片色差测定：使用CR2500型色差计(日本MINOLTA公司)测定叶片亮度(L值)、变红度(a*值)、变黄度(b*)；每个叶片在避开叶脉处随机选择10个点，以其平均值作为该叶片平均值，3个叶片的平均值作为该单株的叶色值。利用a*、b*值计算色泽饱和度(C*)和色调角(θ)，C*=(a*2+b*2)/2，θ=arctan(b*/a*)。计算叶片颜色指数(I)，I=(180-θ)/(L*+C*)；采用红色葡萄果实颜色指数的方法评价果实的外观色泽，I<2为黄绿、2≤I<4为粉红、4≤I<6为深红、I≥6为蓝黑[4]。

叶片正面显微观测：将叶片切成1 cm×1 cm小块，使用OLYMPUS-BX51型光学显微镜在40倍下观看呈色特征，并用RX100数码相机拍照。

花色苷的测定：根据Rabino的方法(并加以改进)[5]测定。将新鲜叶片用清水洗净去污，准确称量剪去叶脉的叶片0.1 g(精确到0.01 g)，研磨加入体积分数为1%的HCl甲醇溶10 mL，于32 ℃恒温培养箱中5 h，不时摇荡，取出过滤。体积分数为1%的HCl甲醇溶液稀释5倍后作为待测液。以体积分数为1%的HCl甲醇溶液为对照，分别测定530、657 nm处吸光值；每个品种重复5次，每次以相同波长下的2个吸光值的平均值进行花色苷质量分数(wA)计算。wA=(A530-0.25×A657)V/(W×1 000)，式中的A530为530 nm处的吸光值、A657为657 nm处的吸光值、V为提取液体积(单位为mL)、W为样品鲜质量(单位为g)。

叶绿素的测定：采用Fadeel的方法[6]测定叶绿素和类胡萝卜素质量分数。称量剪去叶脉后成熟叶片0.1 g(精确到0.01 g)，加入体积分数为90%的丙酮溶液10 mL，黑暗研磨后(4 000 r/min)离心10 min，然后取上清液用于测定445、644、662 nm处的吸光值；每个品种重复5次，每次以相同波长下2个吸光值的平均值进行光合色素质量分数计算。

叶绿素a质量分数wa=(9.78×A662-0.99×A644)V/(W×1 000)；

叶绿素b质量分数wb=(21.4×A644-4.65×A662)V/(W×1 000)；

总叶绿素质量分数wt=wa+wb；

类胡萝卜素质量分数wcar=(4.69×A445)V/(W×1 000)-0.268×(wa+wb)。

式中：A为在一定波长下的吸光值；w为色素质量分数(单位为mg·g-1)；V为提取液体积(单位为mL)；W为样品鲜质量(单位为g)。

叶片中蔗糖、葡萄糖、果糖的测定：取整片叶子，研钵磨碎，纯水定容100 mL，超声提取1 h。采用ICS-3000离子色谱仪，AminoPac PA-10(2×250 mm)氨基酸分析柱，流动相A为超纯水，流动相B为浓度250 mmol/L的NaOH溶液。流速0.8 mL/min；柱温30 ℃；进样体积25 μL。每个样品进行技术重复3次，以3次平均值作为可溶性糖质量分数。

叶片pH值测定：根据马树华[7]测定叶片汁液pH值方法，取新鲜同位叶0.5 g，洗净并晾干后剪碎研磨成匀浆，加蒸馏水30 mL，震荡6 min后过滤，用MP522台式酸度计测定其pH值。

数据处理：使用Excel2007进行数据整理，使用SPSS16.0软件进行单因素方差分析和多重比较(LSD法)。

2 结果与分析

2.1 3个杜仲品种叶片颜色的差异

由表1可见：方差分析结果，‘红叶’杜仲L值和b*值，显著低于‘密叶’杜仲和‘小叶’杜仲；而a*值和颜色指数，则显著高于‘密叶’杜仲和‘小叶’杜仲。‘红叶’杜仲的叶色a*值高于0，说明其叶色偏红；而其他无性系a*值均低于0，叶色均为绿色。‘红叶’杜仲颜色指数为5.5，达到深红的级别，而其他的无性系则在1.35～1.86，显示为黄绿级别，从色差角度评价‘红叶’杜仲与其他品种差别明显。

表1 3个杜仲品种叶片色差值

注：表中数据为“平均值±标准差”；同列数字后不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)。

2.2 3个杜仲品种叶片显微观测的差异

‘红叶’杜仲的叶片正面，在显微镜下放大40倍后发现，红色细胞与绿色细胞相间排列，而‘小叶’杜仲、‘密叶’杜仲的叶片正面却没有观测到红色细胞。正是因为红绿细胞相间分布，才使得肉眼看到的‘红叶’杜仲呈色与其他品种不同。

2.3 3个杜仲品种光合色素的差异

由表2可见：方差分析结果，‘小叶’杜仲wa、wt，显著高于‘密叶’杜仲和‘红叶’杜仲；3个杜仲品种wb，无显著差异；‘红叶’杜仲的wcar，显著高于‘小叶’杜仲和‘密叶’杜仲。3个品种的wa/wb，‘小叶’杜仲显著高于‘密叶’杜仲和‘红叶’杜仲。‘红叶’杜仲wA、wcar，显著高于‘密叶’杜仲和‘小叶’杜仲；‘红叶’杜仲的wA/wt为0.195 6、wcar/wt为0.286 6，显著高于另外2个品种。由此结果可知，wA、wcar较高，且wA/wt和wcar/wt较大，是‘红叶’杜仲叶片呈红色的主要原因。

‘小叶’杜仲 ‘红叶’杜仲 ‘密叶’杜仲

图1 3个杜仲品种的显微观测(40倍)

杜仲wa/wbwt/wcarwcar/wt‘小叶’杜仲(2.82±0.23)b(4.64±0.51)b(0.2177±0.0272)a‘密叶’杜仲(2.53±0.11)a(4.29±0.52)b(0.2360±0.0312)a‘红叶’杜仲(2.43±0.08)a(3.52±0.39)a(0.2866±0.0320)b

杜仲wcar/mg·g-1wA/mg·g-1wA/wt‘小叶’杜仲(0.3847±0.0166)a(0.1649±0.0138)a(0.0925±0.034)a‘密叶’杜仲(0.3634±0.0586)a(0.1408±0.0218)a(0.0917±0.021)a‘红叶’杜仲(0.4455±0.0535)b(0.3042±0.0232)b(0.1956±0.026)b

注：表中数据为“平均值±标准差”；同列数字后不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。

2.4 3个杜仲品种叶片中可溶性糖和pH值

植物叶片可溶性糖质量分数对花色苷合成有重要作用，而叶片pH值可对花色苷颜色产生影响。由表3可见：3个品种间的pH值和可溶性糖均无显著差异，说明叶片花色苷的呈色与这些条件无关，主要叶色差异的原因是色素种类及含量的差异。

表3 3个杜仲品种叶片可溶性糖和pH值测定结果

注：表中数据为“平均值±标准差”。

3 结论与讨论

‘红叶’杜仲的叶片正面在显微镜下放大40倍后发现，红色细胞与绿色细胞相间排列，而‘小叶’杜仲与‘密叶’杜仲的叶片正面却没有观测到红色细胞。

叶片颜色是一个复合性状，通过表色系统法可对叶片颜色进行量化，增加了准确性及可比性，在研究植物的叶色遗传变异中发挥重要作用[8]。但该方法在植物叶片颜色测定中应用尚为普及，国内朱书香、葛雨萱等研究植物色素含量与叶色参数的关系中有所涉及[9-10]。本研究得到‘红叶’杜仲的叶片色差值与其他品种存在极显著差异，其叶片颜色指数为5.5，可以达到深红级别，而其他品种均为绿色级别。

3个品种间的pH值和可溶性糖均无显著差异，说明叶片花色苷的呈色与这些条件无关，主要叶色差异的原因是色素种类及含量的差异。本研究与庞秋颖等[11]在槭树属研究得到树冠外围的叶片花色素苷显著高于树冠内部，但二者间的细胞液pH值及可溶性糖质量分数则没有显著差异的结果类似。彭少兵等[3]研究得到，在8—9月份，紫叶杜仲叶片细胞液pH值均大于绿叶杜仲叶片细胞液pH值，而可溶性糖质量分数与花色素苷相关性不强。

植物叶片最终呈色，与叶绿素、类胡萝卜素及花色苷等质量分数存在显著的正相关关系；普通叶片呈现绿色或黄色，是由于叶绿素质量分数、类胡萝卜素质量分数所占比例不同；而红(紫)色植物叶色中起决定性作用的呈色物质，是花色苷[12]。本文研究得到，‘红叶’杜仲的wA和wcar较高，且wA/wt和wcar/wt也分别高于其他品种，此为‘红叶’杜仲叶色特殊的直接原因。

[1] 李芳东，杜红岩.杜仲[M].北京：中国中医药出版社，2001.

[2] 杜红岩，胡文臻，俞锐.杜仲产业绿皮书：中国杜仲橡胶资源与产业发展报告[M].北京：中国社会文献出版社，2013.

[3] 彭少兵，张春贺，任利益，等.紫叶杜仲叶色变异研究[J].浙江林业科技，2013，33(3)：61-66.

[5] RABINO I， MANCINELLI A L. Light， temperature， and anthocyanin production[J]. Plant Physiology，1986，81(3)：922-924.

[6] Fadeel A A. Location and properties of chloroplasts and pigment determination in roots[J]. Physiologia Plantarum，1962，15(1)：130-146.

[7] 马树华.四种北方阔叶树苗木对汽车尾气污染的生理反应及抗性评价[D].哈尔滨：东北林业大学，2004.

[8] 李保会，张芹，史宝胜，等.不同叶龄七叶树叶片面积、叶色及主要物质含量变化研究[J].河北农业大学学报，2007，30(5)：32-35.

[9] 葛雨萱，王亮生，周肖红，等.香山黄栌叶色和色素组成的相互关系及时空变化[J].林业科学，2011，47(4)：38-42.

[10] 朱书香，杨建民，王中华，等.4种李属彩叶植物色素含量与叶色参数的关系[J].西北植物学报，2009，29(8)：1663-1669.

[11] 庞秋颖，卓丽环.槭树树冠秋季变色过程中叶片生理指标的空间差异[J].东北林业大学学报，2007，35(6)：16-17，20.

[12] 陈玺中.全红杨呈色物质机理研究[D].雅安：四川农业大学，2014.

Leaf Physiological Characteristics of Three OrnamentalEucommiaulmoidesOliver Varieties//

Zhu Jingle

(Paulownia Forestry Research and Development Centre, State Forestry Administration, Zhengzhou 450003, P. R. China);

Miao Zuoyun

(Huanghe Science and Technology College);

Zhang Shaowei

(Henan Vocational College of Agriculture);

Zhang Mingyuan

(Research Center of Cold Temperate Forestry, CAF);

Ma Shunxing

(Henan Investment Group Corporation Ltd.)

//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(8)：10-13.

With the leaves ofEucommiaulmoides‘Hongye’,E.ulmoides‘Miye’ andE.ulmoides‘Xiaoye’ of two-year-old grafted saplings cultured in a nursery in Yuanyang, under a microtelescope, we studied the leaf physiological characteristics including the chromatic aberration value, pigment content, soluble sugar content and pH value. There were a large number of red cells on the front ofE.ulmoides‘Hongye’ leaf while there was no red cell on the other two varieties. Sluminance (L value) ofE.ulmoides‘Hongye’ was 28.17. Its redness degree (a*value) was 0.96, and the yellowness degree (b*value) was 2.69. The color index of ‘Hongye’ was 5.54, which was in crimson level. The content of chlorophyll a (wa) inE.ulmoides‘Hongye’ leaf was 1.100 9 mg·g-1, that of chlorophyll b (wb) was 0.454 5 mg·g-1, carotenoid content (wcar) was 0.445 5 mg·g-1, and total chlorophyll content (wt) was 1.555 4 mg·g-1. The contents of anthocyanins (wA), glucose, fructose, and sucrose were 0.304 2, 2.94, 1.20, and 2.12 mg·g-1, respectively. The pH value was 5.90. According to variance analysis, the chromatic aberration value and pigment content were significantly different betweenE.ulmoides‘Hongye’ and other varieties while there was no significant difference of pH value and soluble sugar content among three varieties. The leaf color difference among the three varieties could be explained by the difference of pigment types and contents.

EucommiaulmoidesOliver; Leaf physiological characteristics; Leaf color

1)中国林业科学研究院中央级公益性科研院所基本业务费专项资金(CAFYBB2014QA037)；河南省重点科技攻关项目(162102110090)；“十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAD21B0502)。

朱景乐，男，1982年5月生，国家林业局泡桐研究开发中心，副研究员。E-mail：zhujingle1982@126.com。

张明远，中国林业科学研究院寒温带林业研究中心，工程师。E-mail：sourplum@163.com。

2017年4月24日。

S718.4

责任编辑：张 玉。