赵春临 董志远 余洋 张红雨 李鹏辉 王水生 丁朝辉 徐化楠

(郑州大学第一附属医院 胃肠外科 河南 郑州 450052)

胃癌组织氨基酸代谢的研究

赵春临 董志远 余洋 张红雨 李鹏辉 王水生 丁朝辉 徐化楠

(郑州大学第一附属医院 胃肠外科 河南 郑州 450052)

目的观察胃癌组织、癌旁正常组织氨基酸谱的变化规律。方法使用超高效液相色谱串联质谱的方法检测40例胃癌患者癌组织、癌旁正常组织19种氨基酸的含量。结果Ⅰ、Ⅱ期胃癌组织中氨基酸含量与癌旁正常组织相比，差异无统计学意义，Ⅲ、Ⅳ期胃癌组织中氨基酸与癌旁正常组织相比，苏氨酸、酪氨酸、丝氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、蛋氨酸和谷氨酰胺的含量增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论Ⅲ、Ⅳ期胃癌组织中多种氨基酸含量升高，表明胃癌组织存在明显的氨基酸代谢异常，这种代谢异常可为氨基酸失衡疗法提供临床依据。

胃癌；氨基酸；超高效液相色谱串联质谱；氨基酸失衡疗法

尽管胃肿瘤相关性的死亡率已经有所下降，但是胃癌仍是第四最常见的癌症类型和全球癌症死亡的第二大原因[1]。由于大部分胃癌患者确诊时已经是中晚期，所以其常表现出不同程度的营养不良，并伴随严重的蛋白质-氨基酸代谢紊乱，导致患者体力下降，免疫力低下，在放化疗时由于副反应又常常进食不足，进一步加重营养不良，患者在此状态下接受治疗，治疗效果可能有所折扣，并带来各种并发症，加速患者死亡[2]。因此，营养支持对于胃癌患者异常重要。如何制定合理的营养治疗方案，制成某种氨基酸过量或减少乃至缺失的不平衡氨基酸(amino acid imbalance，AAI)，既能抑制肿瘤生长，又能改善患者营养状况，即采用氨基酸失衡疗法，以补充支持现有的胃癌治疗手段，是胃癌综合治疗需要探索的一个重要方面[3]。本研究通过超高效液相色谱串联质谱的方法检测胃癌患者癌灶、癌旁组织游离氨基酸含量，了解胃癌氨基酸代谢轮廓的改变，为胃癌患者氨基酸失衡疗法提供临床依据。

1 材料和方法

1.1研究对象检测标本取自2015年12月至2016年4月郑大一附院住院手术的40例胃癌患者。其中男29例，女11例，年龄25～77岁，平均59.7岁，体质量指数(body mass index，BMI)17.3～26.2 kg/m2，BMI平均值为22.6 kg/m2。术后经病理证实胃管状腺癌36例，印戒细胞癌4例。术后病理分期Ⅰ期、Ⅱ期各6例， Ⅲ期9例 ，Ⅳ期19例。纳入标准：术前均行胃镜及活检病理、全腹部CT扫描、上消化道钡餐造影、心电图、血生化检查及术后常规病理检查；术前均未接受放化疗；肝肾功、心电图及其他生化指标正常，无内分泌及代谢性疾病。

1.2实验方法共测量19种游离氨基酸的含量，其中必需氨基酸(essential amino acid，EAA)7种，分别为：缬氨酸(Val)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)及苏氨酸(Thr)；非必需氨基酸(nonessential amino acid，NEAA)12种，分别为：丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、门冬氨酸(Asp)、胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、鸟氨酸(Orn)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)和酪氨酸(Tyr)。具体实验方法如下。

1.2.1标本取材方法 术中取胃癌标本时，取癌灶组织+癌旁组织(距离癌灶边缘5 cm以上，在同一水平面上，组织重量需>1 g)，放于5 ml离心管中，迅速使用冰盐水洗涤3次，除去血污(放于烧杯中清洗)，随后使用滤纸吸干并转移至冻存管中，后将冻存管存放于液氮中。

1.2.2标本上机前处理 将组织(50 mg)加入1.5 ml冰冷的50%甲醇中，匀浆(A) ，随后在16 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min(B)，取上清，加入120 μl的50%甲醇，重悬获得极性成分后上机进行检测；或者将组织(50 mg)加入1.5 ml冰冷的50%甲醇，匀浆(A)，然后在16 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min(B)，在获得的沉淀中加入1.6 ml CHCl2∶乙腈(3∶1)，重复A、B操作，随后挥干上清，加入120 μl的50%甲醇重悬，获得非极性成分，最后上机进行检测。

1.3实验仪器参数设定①超高效液相色谱(UPLC)条件：本实验使用的液相色谱仪为Dionex的UltiMate 3000包括液相泵(HPG-3400 SD)、柱温箱(TCC-3000 SD)和自动进样器(WPS-3000SL)，组织样品采用ACQUITY ULC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)及UPLC C18 保护柱(2.1 mm×5 mm)(Water 中国有限公司)进行检测，柱温为40 ℃，自动进样器温度为4 ℃，流动相A为水+0.1%甲酸，B为乙腈+0.1%甲酸(见表1)。②质谱条件：质谱检测所用的仪器为Thermo公司生产的四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(Q Exactive)，离子源为加热型电喷雾(HESI)，扫描模式分别为ESI+，离子源温度为300 ℃，喷雾电压为3.6 kV，传输毛细管温度为320 ℃，鞘气流速为40 arb，辅助气流速为10 arb；扫描模式为Full MS，Full MS/dd-MS2，扫描质量范围为60～900 m/z，一级扫描和二级扫描分辨率分别为70 000和17 500。

表1 组织样品流动相梯度洗脱条件

2 结果

2.1胃癌与癌旁正常组织中氨基酸含量的对比胃癌组织中Val、Met、Thr、Gln、Gly、Pro含量高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)，EAA、NEAA、TAA含量也高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.2Ⅲ、Ⅳ期肿瘤组织与癌旁正常组织氨基酸含量对比Ⅲ、Ⅳ期肿瘤组织中Thr、Tyr、Val、Pro、Met、Gln、Gly、Ser含量高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)，且EAA、NEAA、TAA含量均增加(P<0.05)。见表3。

表2 胃癌组织与癌旁正常组织游离氨基酸含量的变化

注：EAA，必需氨基酸；NEAA，非必需氨基酸；TAA，总氨基酸。

3 讨论

平衡氨基酸的营养支持对肿瘤的促增值作用，以及不平衡氨基酸对肿瘤的抑制作用，使得更多关于不平衡氨基酸与肿瘤生长的实验研究被进一步深入开展[4]。本研究结果表明，在Ⅲ、Ⅳ期肿瘤组织中多种游离氨基酸含量明显增高，且EAA、NEAA、TAA含量均高于癌旁正常组织，肿瘤组织的高氨基酸含量可能反应肿瘤组织对氨基酸需求较高以进行能量代谢、核酸及新的蛋白质合成，并且癌组织游离氨基酸的变化与肿瘤的进展程度相关。同时Ⅲ、Ⅳ期肿瘤组织中Thr、Tyr、Val、Pro、Met、Gly、Ser及Gln的显著增加可能提示肿瘤组织对这几种氨基酸的特殊需求，正常组织中的一些非必需氨基酸可能就是肿瘤组织的必需氨基酸，这也是氨基酸失衡疗法的理论基础[5]。国内关于癌症患者癌组织内游离氨基酸谱的变化已有多篇文献报道，各类恶性肿瘤细胞的代谢规律也不尽相同，有其不同而又特殊的游离氨基酸代谢改变[6]。王倩等[7]研究发现Ⅲ、Ⅳ期胃癌组织游离氨基酸含量出现特征性病理改变：Ⅲ期TAA含量增加，Thr、Met、Ile、Leu、Val、Ala、Tyr、Pro、Ser、Gly含量增加；Ⅳ期TAA含量增加，Met、Leu、Thr、Ile、Asp、Gly、Pro、Ser及Glu含量增加。王亮等[8]研究发现胃癌组织游离Gln、Arg、Met含量较正常胃黏膜明显增高，而Ala、Try含量较正常胃黏膜降低。

表3 Ⅲ、Ⅳ期胃癌组织与癌旁正常组织氨基酸含量比较

肿瘤组织对糖的需求增加，宿主细胞只能通过分解蛋白质提供大量的氨基酸，糖异生可达到此目的。Pro、Thr、Ser、Val、Met及Gln均是生糖氨基酸，故在肿瘤组织中增加。Met是含硫必需氨基酸，是体内物质代谢的主要甲基供体，参与众多活性物质的甲基化反应，而肿瘤组织在分化过程中需要大量的Met进行甲基化[9]。Val是一种支链氨基酸，为肿瘤生长代谢所必需。He等[10]研究发现去Val和去Met均能抑制荷瘤大鼠肿瘤的生长。去除Val抑癌效果虽明显，但最大的不良反应是脂肪肝的发生率高，宿主也会出现体质量减轻、腹泻、低蛋白血症等症状[11]。

肿瘤生长时明显改变了宿主的蛋白质和氨基酸的代谢，并导致机体不同程度的营养不良。本研究认为，在胃癌的氨基酸失衡液中应减少Thr、Tyr、Val、Pro、Met、Gly、Ser及Gln等氨基酸的含量，使得它们在支持宿主的同时又不会促进肿瘤的生长，甚至抑制肿瘤的生长，但同时必须重视氨基酸最低需要量的问题。目前，氨基酸失衡疗法抗肿瘤的研究已经取得了很大的进展，氨基酸相关研究的目的正朝着增强抗癌药物的敏感性、改善患者代谢和增强免疫功能的方向发展。因此，在深入了解胃癌组织与癌旁正常组织代谢差异的基础上结合临床，寻找更加合理的氨基酸失衡液的组成及含量，才能更有效地抑制肿瘤生长并改善患者的代谢。

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RecentStudiesonAminoAcidMetabolisminGastricCarcinoma

Zhao Chunlin, Dong Zhiyuan, Yu Yang, Zhang Hongyu, Li Penghui, Wang Shuisheng, Ding Chaohui, Xu Huanan
(TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450000,China)

ObjectiveTo investigate the metabolism of amino acids in gastric carcinoma tissues and adjacent normal tissues.MethodsNineteen kinds of amino acids in gastric carcinoma tissues and adjacent tissues were detected by ultrahigh performance liquid chromatography(UPLC)tandem masss pectrometry method.ResultsThe contents of amino acids were not significantly changed in gastric carcinoma withⅠandⅡstage, Compared with adjacent normal tissues, contents of Thr, Tyr, Ser, Gly, Val, Pro, Met and Gln increased significantly in gastric carcinoma tissues with Ⅲand Ⅳstage.ConclusionsThe amino acid in gastric carcinoma tissues with Ⅲand Ⅳstage were significantly changed, which showed that there were obvious metabolism abnormalities of amino acid in gastric carcinoma, providing clinical evidence for amino acid imbalance therapy.

gastric carcinoma；amino acid；ultrahigh performance liquid chromatography tandem masss pectrometry；amino acid imbalance therapy

赵春临，E-mail：zhao_chunlin@163.com。

R 735.2doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2017.15.004

2016-11-28)