潘光照，张奎，李重阳，赵羽卒，申利，徐曼，苏晶晶，林西，崔红娟



家蚕组织蛋白酶L（Bm）基因鉴定、表达及其功能分析

潘光照，张奎，李重阳，赵羽卒，申利，徐曼，苏晶晶，林西，崔红娟

（西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆 400716）

【目的】鉴定克隆家蚕组织蛋白酶L基因Bm（Bm），分析其序列和表达特征。分析家蚕组织蛋白酶L在大肠杆菌诱导下mRNA表达量的变化趋势，为进一步研究家蚕组织蛋白酶L的功能打下基础。【方法】基于家蚕基因组数据库（SilkDB）中序列BGIBMGA006893设计引物，利用RACE技术克隆家蚕组织蛋白酶L基因的cDNA全长序列，通过在线工具对基因结构和蛋白质分子量及等电点进行预测；在NCBI数据库下载其他物种组织蛋白酶L同源序列，利用Clustalx（1.83）和MEGA 6.0 软件进行同源比对并构建进化树。运用RT-PCR和qRT-PCR对其时空表达特征进行分析。选取该基因的特异性片段，经PCR扩增，测序验证后将其连接至pET-28载体，转化至Rosseta感受态表达菌株，经IPTG在适宜温度条件下诱导，获得组织蛋白酶L重组蛋白。然后再利用镍离子亲和层析法对该蛋白进行纯化，获得纯度较高的重组蛋白。最后利用大肠杆菌对家蚕血液系统进行攻毒，检测家蚕组织蛋白酶L基因的表达水平。【结果】通过查询家蚕基因组数据库和生物信息学分析得出，家蚕组织蛋白酶L基因定位于家蚕第10号染色体上，基因编号为BGIBMGA006893, nscaf2860。基因开放阅读框全长687 bp，编码228个氨基酸，含有保守的Pept_C1结构域。通过在线网站预测，得出该蛋白酶的分子量为26.132 kD，等电点为4.57。进化分析表明该基因与同为鳞翅目昆虫的草地贪夜蛾和黑脉金斑蝶亲缘关系最为接近。……