安坤 周文斌

吉兰-巴雷综合征患者血浆Sema-4A水平与免疫细胞相关性研究

安坤 周文斌

目的 检测sema-4A在吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barré syndrome，GBS)患者外周血血浆中及免疫细胞中的表达水平，探讨sema-4A在GBS致病机制中的作用。方法 选择作者医院收治的GBS患者18例，另选健康体检者18名作对照，并根据hughes评分将GBS患者划分为轻型与重型。收集GBS患者急性期、恢复期及对照组外周血血浆及单个核细胞，利用ELISA法检测外周血血浆中sema-4A表达水平，比较各组血浆sema-4A表达量变化。通过流式细胞术检测sema-4A在DC细胞、B细胞、CD4+T细胞等单个核细胞的表达，比较各类单个核细胞表达sema-4A的差异。分析血浆sema-4A表达水平与表达sema-4A的免疫细胞频率及疾病严重程度的相关性。结果 GBS患者急性期血浆sema-4A的表达水平〔(0.6162±0.1440)ng/mL〕高于恢复期及对照组〔分别(0.1071±0.0328)ng/mL、(0.0904±0.0249)ng/mL)，均P<0.05〕。重型GBS患者急性期血浆sema-4A表达水平高于轻型GBS〔分别为(0.7351±0.1172) ng/mL、(0.5009±0.0825)ng/mL，t=2.467，P=0.035)〕。GBS急性期患者血浆sema-4A表达水平与hughes评分呈正相关(r=0.79，P=0.025)。GBS急性期患者表达sema-4A的DC细胞频率〔(3.7260±0.7516)%〕及B细胞频率〔(2.8072±0.5548)%〕高于恢复期〔分别为(1.6912±0.4322)%、(1.6039±0.3091)%；均P<0.05〕及对照组〔分别为(1.7194±0.3624)%、(1.5027±0.3208)%；均P<0.05〕。GBS急性期患者表达sema-4A的DC细胞频率与血浆sema-4A表达水平之间呈正相关(r=0.95，P=0.032)。结论 GBS急性期Sema-4A表达增高，并与病情严重程度及DC细胞频率相关。Sema-4A可能是GBS急性期病情严重程度的一个评价指标。

吉兰-巴雷综合征；sema-4A；DC细胞

吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barré syndrome，GBS)是一种影响周围神经的炎性自身免疫性脱髓鞘疾病[1]。尽管有血浆置换、静脉注射免疫球蛋白、糖皮质激素等多种免疫治疗方法，GBS患者中仍有20%以上遗留严重残疾，死亡率高达5%[2]。大量研究发现体液免疫与细胞免疫共同参与此病的发生，T细胞及其分泌的相关细胞因子在GBS发病机制中起着重要的作用，但其具体发病机制仍未明确[3-4]。

Sema-4A是Ⅳ类信号素(semaphorins，semas)，属于信号素家族[5]。Sema-4A可以在DC细胞及B细胞等多种免疫细胞中表达[6]。研究发现其受体为T细胞免疫球蛋白粘蛋白-2(the T cell, immunoglobulin and mucin domain proteins-2，TIM-2)。Sema-4A激活TIM-2可以诱导TIM-2酪氨酸激酶的磷酸化，进而启动下游信号通路参与T细胞免疫功能的调节[7]，在类风湿性关节炎[8]、多发性硬化[9]等免疫炎性疾病的发展病程中均起了重要作用。然而sema-4A在GBS中的表达水平及其是否参与了GBS的致病机制，目前国内外尚无相关研究报道。本研究拟通过检测在GBS患者急性期及恢复期外周血中sema-4A水平及sema-4A在多种免疫细胞中的表达，探讨sema-4A在GBS疾病演变过程中的规律。

1 对象和方法

1.1 观察对象 研究病例来源为2013-03-01—2014-03-01中南大学湘雅医院神经内科病房住院治疗的GBS患者18例，其中男12例、女6例，年龄14～67岁，平均年龄为(47.56±16.21)岁，患者均符合2010年修订的GBS诊断标准。入组的所有GBS患者均排除近期心脑血管疾病、肿瘤及其他自身免疫性疾病。根据Hughes评分(轻症患者1～3分之间，重症患者4～6分之间)，本组轻型为7例，重型为11例。本组脱髓鞘型10例，轴索型6例，脱髓鞘伴轴索损害2例(在进行脱髓鞘型和轴索型两型之间比较时此2例排除在外)。选取中南大学湘雅医院门诊体检中心的健康体检者18名，其中男12名、女6名，年龄18～60岁，平均(46.72±14.13)岁。入组标准：均排除神经系统疾病、免疫疾病，无感染性疾病、肿瘤等相关疾病。病例组和对照组年龄性别相匹配。本研究中的所有患者及对照组志愿者均了解研究目的及研究意义，并自愿签署研究知情同意书，愿意参与此次实验研究。

1.2 方法 所有入选的GBS患者分别在疾病急性期(即发病1～14 d)及恢复期(即发病30～60 d)采集外周血标本10 mL，置于5 mL EDTA管中，每管5 mL。其中一管离心后取上清，将血浆冻存于-80℃，备用于ELISA法进行sema-4A检测，另一管血用于提取外周血单核细胞(PBMC)，采用美国BD FACSCantoTMII流式细胞仪检测sema-4A在CD4+T细胞、B细胞、DC细胞的表达。先根据前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)光信号，对PBMC进行设门，再分别对CD4+T细胞、DC细胞、B细胞进行设门。根据各同型对照确定各细胞分群散点图的分界游标。每份标本至少收集5×104个PBMC，用配套的软件对数据进行分析，分别得到sema-4A在CD4+T细胞、B细胞、DC细胞的表达频率(百分率)。分析不同疾病分期及不同分型GBS患者sema-4A表达，并分析急性期sema-4A水平与表达sema-4A的CD4+T细胞、B细胞、DC细胞频率及Hughes评分的相关性。

本研究所有检测项目均经过三次独立实验重复验证。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示。两组间定量资料的比较采用两独立样本t检验；多组定量资料的组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。相关分析采用Pearson相关性分析方法。计数资料样本的比较釆用卡方检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GBS患者急性期、恢复期及对照组血浆sema-4A水平比较 具体见表1。GBS急性期、恢复期、对照组三组间血浆sema-4A水平比较差异有统计学意义(F=16.69，P=0.000)，GBS 患者急性期血浆中sema-4A表达水平高于恢复期(t=3.356，P=0.002)及对照组(t=3.261，P=0.003)；GBS患者恢复期血浆sema-4A表达水平与对照组差异无统计学意义(t=0.723，P=0.568)。脱髓鞘型、轴索型GBS患者急性期血浆sema-4A水平均高于恢复期及对照组(均P<0.05)，急性期及恢复期脱髓鞘型与轴索型GBS之间比较sema-4A水平差异无统计学意义(均P>0.05)。

表1 各组血浆sema-4A水平比较(n=18，±s，ng/mL)

注：F值、P值为三组间比较所得；t值、P1值为脱髓鞘型与轴索型比较所得；与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与恢复期比较，#P<0.01

表2 GBS患者与对照组表达sema-4A的DC细胞、B细胞和CD4+T细胞频率比较

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与恢复期比较，#P<0.05

2.2 轻型与重型GBS患者血浆sema-4A水平比较 重型GBS患者急性期血浆sema-4A水平高于轻型GBS患者〔分别为0.7351±0.1172) ng/mL、(0.5009±0.0825) ng/mL，t=2.467,P=0.035〕。重型GBS患者恢复期血浆sema-4A水平与轻型GBS患者相比差异无统计学意义〔分别为(0.1099±0.016) ng/mL、(0.1064±0.0194) ng/mL，t=0.962，P=0.773〕。

2.3 GBS患者急性期血浆sema-4A水平与hughes评分的相关性分析 GBS患者急性期血浆sema-4A水平与hughes评分呈正相关(r=0.7905，P=0.025)。

2.4 GBS患者与对照组表达sema-4A的DC细胞、B细胞和CD4+T细胞频率比较 GBS患者急性期表达sema-4A的DC细胞、B细胞频率均高于恢复期及对照组(均P<0.05)，对照组与GBS患者恢复期比较差异无明显统计学意义(P>0.05)；急性期、恢复期患者与对照组表达sema-4A的CD4+T细胞频率差异均无统计学意义(P>0.05)。具体见表2。

2.5 GBS患者急性期表达sema-4A的CD4+T、B、DC细胞频率与血浆sema-4A表达水平的相关性分析 GBS患者急性期表达sema-4A的DC细胞频率与血浆sema-4A表达水平呈正相关(r=0.95，P=0.032)；表达sema-4A的B细胞、CD4+T频率与血浆sema-4A表达水平不存在相关性(r=-0.301，P=0.45；r=0.029，P=0.67)。

3 讨论

GBS是一种影响周围神经的炎性自身免疫性疾病，大量研究发现体液免疫与细胞免疫共同参与此病的发生[1]。sema-4A对于T细胞分化及功能调节具有重要的作用[5]。既往动物研究表明，sema-4A参与Th1/Th2细胞比例的调节以及Th17细胞及Treg细胞的功能调节[10]。而T细胞及其分泌的细胞因子在GBS发病过程中发挥着重要作用[1]，由此可见sema-4A可能通过调节T细胞分化及功能参与GBS发病。

3.1 Sema-4A表达水平与GBS患者急性期严重程度呈正相关 MS与GBS同是T细胞参与的脱髓鞘性疾病。既往多项研究表明，sema-4A在MS中发挥了重要作用。Nakatsuji等[11]研究发现，sema-4A在MS中的表达升高，通过调节Th17细胞的分化参与MS发病过程；而且MS患者sema-4A表达水平越高，病情越重，并且对IFN-β治疗效果越差。一项动物实验表明sema-4A在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)表达升高，并可抑制IFN-β对EAE的治疗作用[12]。是否sema-4A也参与了GBS的疾病过程，本研究进行了探索。本研究结果显示，sema-4A在GBS患者急性期血浆中的表达水平较恢复期及对照组明显升高，GBS急性期hughes评分为重型的患者sema-4A表达量较轻型患者升高，而且GBS急性期血浆sema-4A水平与hughes评分呈正相关，即hughes评分越高，sema-4A的表达水平越高。以上结果均提示sema-4A水平与GBS病情严重性有关，其对判定GBS疾病演变也可能具有一定的作用，由此推测sema-4A可能是GBS急性期促进GBS病情发展的重要的细胞因子。

3.2 表达sema-4A的DC细胞、B细胞、CD4+T的细胞在GBS中的作用 Wang等[13]的临床研究发现DC细胞在GBS急性期表达升高，并与GBS的严重程度存在正相关性，提示DC细胞在GBS发病机制中起重要主要，但其具体机制未明。既往研究发现sema-4A主要来源于DC细胞、B细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞，而DC细胞来源的sema-4A在MS发病过程中起促进作用[11]。本研究发现GBS急性期表达sema-4A的DC细胞及B细胞频率均较恢复期及对照组升高，而且GBS急性期患者血浆sema-4A表达水平与表达sema-4A的DC细胞频率呈正相关，而与表达sema-4A的B细胞频率无相关性，同时表达sema-4A的CD4+T细胞频率无明显变化，提示DC细胞可能通过sema-4A参与GBS发病机制，DC细胞来源的sema-4A在GBS发病过程起一定的作用，其具体机制需进一步深入研究。

综上，本研究结果显示sema-4A表达在GBS急性期显著升高，并与疾病严重程度存在相关性，提示sema-4A参与了GBS急性期疾病过程，推测sema-4A可能是GBS病情严重程度的一个评价指标，尚待进一步深入研究。

[1]Willison HJ,Jacobs BC，van Doorn PA.Guillain-Barré syndrome[J] Lancet，2016, 388(10045): 717-727.

[2]Pritchard J,Hughes RA,Hadden RD，at al.Pharmacological treatment other than corticosteroids, intravenous immunoglobulin and plasma exchange for Guillain-Barré syndrome[J]. Cochrane Database Syst Rev，2016, 11:CD008630.

[3]Wu X,Wang J,Liu K，at al.Are Th17 cells and their cytokines a therapeutic target in Guillain-Barré syndrome?[J]. Expert Opin Ther Targets，2016, 20(2): 209-222.

[4]Li S,Jin T,Zhang HL，at al.Circulating Th17, Th22, and Th1 cells are elevated in the Guillain-Barré syndrome and downregulated by IVIg treatments[J] Mediators Inflamm，2014, 2014(5): 740947.

[5]Chapoval SP,Vadasz Z,Chapoval AI，at al.Semaphorins 4A and 4D in chronic inflammatory diseases[J] Inflamm Res，2017, 66(2): 111-117.

[6]Kumanogoh A,Marukawa S,Suzuki K，at al.Class Ⅳ semaphorin Sema4A enhances T-cell activation and interacts with Tim-2[J] Nature，2002, 419(6907): 629-633.

[7]Vadasz Z，Toubi E.Semaphorins: their dual role in regulating immune-mediated diseases[J] Clin Rev Allergy Immunol，2014, 47(1): 17-25.

[8]Wang L,Song G,Zheng Y，at al.Expression of Semaphorin 4A and its potential role in rheumatoid arthritis[J] Arthritis Res Ther，2015, 17(1): 227.

[9]Leitner DF,Todorich B,Zhang X，at al.Semaphorin4A is cytotoxic to oligodendrocytes and is elevated in microglia and multiple sclerosis[J] ASN Neuro，2015, 7(3).

[10]Kumanogoh A,Shikina T,Suzuki K，at al.Nonredundant roles of Sema4A in the immune system: defective T cell priming and Th1/Th2 regulation in Sema4A-deficient mice[J] Immunity，2005, 22(3): 305-316.

[11]Nakatsuji Y,Okuno T,Moriya M，at al.Elevation of Sema4A implicates Th cell skewing and the efficacy of IFN-beta therapy in multiple sclerosis[J] J Immunol，2012, 188(10): 4858-4865.

[12]Koda T,Okuno T,Takata K，at al.Sema4A inhibits the therapeutic effect of IFN-beta in EAE[J] J Neuroimmunol，2014, 268(1-2): 43-49.

[13]Wang YZ,Feng XG,Wang Q，at al.Increased plasmacytoid dendritic cells in Guillain-Barré syndrome[J] J Neuroimmunol，2015, 283:1-6.

(本文编辑：邹晨双)

Analysis of sema-4A in plasma and immune cells of the patients with Guillain-Barré syndrome

ANKun*,ZHOUWenbin.

*DepartmentofNeurology,Huai’anFirstPeople’sHospital,NanjingMedicalUniversity,Huai’anJiangsu223300,China

AN Kun，Email：ankun10011@163.com

Objective To detect the expression of sema-4A,in plasma and CD4+T,B,and DC cells of GBS patients. Methods The plasma and PBMC were collected at the acute stage and recovery period in GBS patients and normal controls. GBS was divided into severe and mild groups according to the hughes scores. The expression of sema-4A was detected by ELISA.The expression of sema-4A in different stages of GBS was compared.The correlation between the level of sema-4A and the severity of GBS was analyzed. The DC,B and CD4+T cells expressed of sema-4A were detected by flow cytometry. The correlation of sema-4A expression on DC,B,and CD4+T cells with the severity of GBS was evaluated. Results The level of sema-4A in plasma significantly increased in the acute phase of GBS patients[(0.6162±0.1440)ng/mL,P<0.05]. The severe GBS patients showed higher plasma level of sema-4A at the acute phase[(0.7351±0.1172) ng/mL)] than mild GBS[(0.5009±0.0825)ng/mL,t=2.467,P=0.035].Hughes scores of acute phase GBS patients was positively correlated with the level of sema-4A in the plasma (r=0.79,P=0.025).DC cell and B cell expressing sema-4A in acute phase of GBS patients significantly increased (P<0.05).DC cells expressing sema-4A in acute phase of GBS patients was positively correlated with the level of sema-4A in the plasma (r=0.95,P=0.032).Conclusions Sema-4A may be an indicator representing disease severity in acute phase GBS.

Guillain-Barré Syndrome;sema-4A;DC cell

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.04.007

223001 南京医科大学附属淮安第一医院神经内科(安坤)；410078 中南大学湘雅医学院神经内科(周文斌)

安坤，Email：ankun10011@163.com

R475.4

A

1006-2963(2017)04-0266-04

2017-01-11)